Fagonia cretica 抽出物を使用した亜鉛ナノ粒子の生物医学および植物化学的応用の比較評価

Scientific Reports volume 12、記事番号: 10024 (2022) この記事を引用

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ナノ粒子合成にグリーンアプローチを使用することは、その環境への優しさ、費用対効果、有毒化学物質の生成の削減により、顕著な懸念を引き起こしました。現在の研究は、ファゴニアクレティカ抽出物を使用して酸化亜鉛ナノ粒子 (ZnO NP) を配合し、その植物化学的含有量とさまざまな生物活性を評価するように設計されました。 4 つの異なる溶媒。抽出方法にはメタノール (MeOH)、n-ヘキサン (n-H)、水溶液 (Aq)、酢酸エチル (EA) が使用されていました。 ZnO NP は合成に成功し、紫外可視分光法と走査型電子顕微鏡 (SEM) によって特性評価されました。 UV-visスペクトルは350-400 nm範囲の吸光度ピークを示し、SEM分析では粒子サイズが65-80 nmの範囲の球状形態を明らかにしました。植物化学分析では、粗抽出物には豊富な二次代謝産物が含まれているため、最も高い植物化学含量を示しました。 n-ヘキサン抽出物は最も高いフェノール含有量を示し、一方、水性抽出物は最も高いフラボノイド含有量を示しました。最大の遊離基消去活性は、酢酸エチル抽出物から合成された NP で観察され、IC50 値は 35.10 μg/ml でした。 NP 極性溶媒は、肺炎桿菌、大腸菌、および枯草菌に対して顕著な抗菌活性を示しました。極性溶媒は、A. フラバスおよび F. ソラニに対してかなりの抗真菌能力を示しました。 nH 抽出物から合成された NP は、ブラインシュリンプに対して LC50 値 42.41 μg/ml の潜在的な細胞毒性活性を示しました。注目すべき抗糖尿病活性は、メタノール抽出物から合成されたナノ粒子、すなわち52.61±0.36%によって示された。プロテインキナーゼ阻害をもたらすメタノール抽出物から合成されたナノ粒子では、顕著な脱毛領域が観察されました。本研究は、実質的な抗酸化作用、抗菌作用、細胞毒性作用、プロテインキナーゼ阻害作用、および抗糖尿病作用を有する機能性ナノ粒子を合成するための天然源としてのF. indicaの重要性を強調している。

人類の文明の始まりから、植物は現在知られている人間の医療提供の最も古い形態の 1 つであると考えられています。薬用植物には多様な治療効果があるため、アーユルヴェーダ、アロパシー、ユナニ、ホメオパシーなどのさまざまな医療システムで使用されています1,2。世界保健機関 (WHO) によると、世界人口の約 80% が主要な医療ニーズを伝統医学に依存しています3。

Fagonia cretica は薬効の高い植物の 1 つであり、予備的な薬理学的研究によってその効果的な薬効が証明されているため、薬剤師にとって非常に興味深い植物です。 Fagonia cretica L. は、高さ 1 ～ 3 フィートの緑色の直立した微細な尖った低木で、主にアルジェリア、エジプト、チュニジア、キプロス、モロッコ、サウジアラビア、およびインド西部とパキスタン全域の乾燥した石灰岩に分布しています5,6。ファゴニア種は、科学医学および民間医学において、さまざまな症状に対して計り知れない治療効果を持つ治療薬であると記載されています7。味は苦くて酸味があり、肝臓、血液、神経、炎症のさまざまな症状に対する薬効が強化されています8。ファゴニア種の抽出物は、解熱剤、抗喘息剤、解毒剤、防腐剤、抗腫瘍剤、抗赤熱剤、強壮剤、苦味剤、利尿剤、鎮痛剤、健胃剤、興奮剤として考えられています9。

ナノテクノロジーは、診断および治療アプローチに多くの応用が行われている急速に発展している分野の 1 つです。 NP は抗菌活性が強化されているため、ナノ抗生物質と考えられています10。高温高圧では、これらの粒子はより安定します11。人体に必須のミネラル成分が含まれているため、無毒であると認められているものもあります。他のものとは対照的に、金属ナノ粒子の治療可能性は比較的高い12,13。これらの特性は多くの研究者を魅了し、さまざまなナノ粒子を合成するための革新的な方法を発見しました。従来の手順では、大量の粒子を合成するのに必要な時間は短くなりますが（物理的および化学的方法）、周囲に有毒な影響を与える防御剤などの有害な化学物質を育成する必要があります。グリーンアプローチで植物を使用することは、環境に優しく、無毒で安全な選択肢として発展しています。植物抽出物を使用したナノ粒子の生合成は費用対効果が高く、タンパク質のパターンにおける固有のキャッピング媒体も提供します14。植物抽出物を介したいくつかの金属 NP のナノ粒子の生合成は、周囲の合成毒性影響を管理するために利用されています 15。

酸化亜鉛は、その優れた特徴と広く使用されているため、他の金属酸化物ナノ粒子と比較して、科学研究や産業において非常に重要です。優れた光学的、熱的、化学的特性を持っています。酸化亜鉛ナノ粒子は、抗菌性と発光機能により、センサー、触媒作用、太陽エネルギー変換、化学貯蔵、化粧品、繊維、塗料、マイクロカプセル反応器、光電材料、および標的薬物送達に応用されています16。植物抽出物から作られた ZnO NP は安定しており、他の供給源のものと比べて形状や大きさが多様です。これらのナノ粒子の製造に使用される方法には、ソルボサーマル合成、直接沈殿、逆ミセル、ゾルゲル法、均一沈殿、音波化学法、水熱分解、マイクロ波照射、熱分解などがあります。ナノ粒子の生物学的合成は簡単で環境に優しく、幅広い抗菌作用があります。 ZnO ナノ粒子の生合成は、化学合成に代わるものであり、大気への毒性が低いことが観察されました 17。グリーン合成は環境に優しく、経済的で迅速であり、製品には汚染物質が含まれません。グリーン合成では、前駆体は必要なく、さまざまな形状と大きさの NP が植物から大量に生成されます。通常、酸化亜鉛ナノ粒子の合成には葉や花が頻繁に利用されます8。

金属ナノ粒子は、さまざまな方法、つまり化学合成および生化学合成を使用して合成できます。通常、安定剤としてアルキルメルカプタン、ポリビニルピロリドン、ジメチルホルムアミド、チオアントラセノール、またはTween 80を使用し、金属ナノ粒子を合成するための還元剤としてヒドラジン水和物、水素化ホウ素ナトリウム、またはホルムアルデヒドを使用します18。これらの方法は、例えばナノ粒子の安定性を維持するために処理に有毒な化学物質を使用しており、また非常に高価である。これらの化学的方法による環境への脅威に対し、世界中の研究者は、いくつかの天然資源を使用して金属ナノ粒子を合成するための、より信頼性が高く環境に優しい方法に焦点を当てました。

同様に、ZnO NP の合成には、さまざまな化学的および物理的方法が使用されています。これらの方法はナノマテリアルの大規模生産には非常に役立ちますが、有毒化学物質の使用により環境や人間の健康に悪影響を及ぼします16。したがって、環境に優しく持続可能な金属ナノ粒子の製造方法が緊急に必要とされています19。したがって、環境汚染のリスクを最小限に抑えるために、さまざまな微生物やさまざまな植物抽出物を使用するなど、ZnO NP の代替製造方法としていくつかの天然資源を使用することができます 20,21。さまざまな生合成アプローチの中で、植物抽出物はさまざまな金属ナノ粒子の合成として世界的な注目を集めています22。多環芳香族炭化水素 (PAH) は、主に永続的かつ長期の人為的汚染原因により世界中に遍在しており、生物圏では極めて残留性が高く、抵抗力があります。 PAH 汚染物質は、さまざまな生命体に対して、高度な変異原性、毒性、発がん性、催奇形性、免疫毒性を有することが確認されています。物理的、化学的、生物学的、そして最近開発された統合的なアプローチを含むさまざまな修復方法が継続的に適用され、成功の程度はさまざまです。この点に関して、最近の研究では、ZnO NP が PAH 修復のための環境に優しい生物学的処理ソリューションとして大きな期待を示していることが実証されています 23。

本研究の焦点は、Fagonia cretica の地上部分から得られた水抽出物、メタノール抽出物、酢酸エチル抽出物、および n-ヘキサン抽出物から生成された ZnO ナノ粒子の生物学的および薬学的特性を調査および評価することでした。さらに、完全なフラボノイドおよびフェノール濃度も、粗抽出物と異なる溶媒の ZnO NP の間で比較されました。酵素阻害アッセイ、すなわちプロテインキナーゼ阻害およびα-アミラーゼ阻害アッセイも実施して、これらの酵素に対するZnO NPの有効性を粗抽出物と比較して測定した。

Fagonia cretica から植物成分を抽出するために、極性勾配アプローチで 4 つの溶媒が使用されました。抽出物の総回収量は植物のすべての部分について計算されました (表 1)。

ZnO NP は、根と葉の酢酸エチル、メタノール、n-ヘキサン、蒸留水抽出物を絶えず撹拌しながら 0.01 M 酢酸亜鉛で処理することにより合成に成功しました。 2 時間のインキュベーション後、溶液の色 (pH 12) がオフホワイトに変化し、亜鉛ナノ粒子の合成が確認されました。溶液を１７６°Ｆで一晩オーブン乾燥させ、ペレットをオーブン乾燥させて純粋なナノ粒子を得た。

走査型電子顕微鏡 (SEM) と紫外可視分光法を使用して、亜鉛ナノ粒子を分析しました。

植物の地上部の抽出物から合成された酸化亜鉛ナノ粒子では、350〜400 nmの範囲に亜鉛ナノ粒子のピークが観察されました（図1）。

酸化亜鉛ナノ粒子の紫外可視吸収スペクトル。 (A) n-ヘキサン (B) 酢酸エチル (C) メタノール (D) 水性。

SEM の結果は、ZnO ナノ粒子の形態、サイズ、粒子分離画像を決定するのに非常に役立つと考えられています。植物の地上部分の 4 つの抽出物すべてについて、粒子が 100 nm 以内であることが確認されました。合成されたZnO NPのサイズは、30 kVで65〜80 nmの範囲内でした（図2）。形状はいくつかの点で異なりましたが、球形が支配的であり、SEM 分析では粒子がよく分散し結合していることが示されました。

酸化亜鉛ナノ粒子のSEM画像。 (A) n-ヘキサン (B) 酢酸エチル (C) メタノール (D) 水性。

総フェノール含有量 (TPC) は、ナノ粒子と比較して粗抽出物で最も高い値を示しました (図 3)。実質的な効果が粗抽出物に見られた。最大ＴＰＣは、ｎ－ヘキサンの粗抽出物、すなわち（５９．３２）、続いてメタノール（５７．５１）、水溶液（５５．４１）、および酢酸エチル（５４．６４）中で測定された。ナノ粒子は、粗抽出物と比較して最小の TPC を示しました。ナノ粒子の場合、最も高い値は水溶液 (33.50) で、次に n-ヘキサン (24.41)、酢酸エチル (21.92)、メタノール (13.01) でした。

F.cretica 粗抽出物とその合成 ZnO NP の総フェノール含有量。与えられた値は、3 回の平均値 ± 標準偏差として表されます。

合成された ZnO NP と比較して、植物の粗抽出物で最も高い TFC が観察されました。最も高いＴＦＣは水性抽出物中で測定され、すなわち９３．７４であり、次いでメタノール（８４．４９）、ｎ－ヘキサン（７８．８７）、および酢酸エチル（６１．２０）であった。合成されたナノ粒子は、粗抽出物と比較して最小の TFC を示しました。ナノ粒子の場合、最高値は n-ヘキサン (36.91) で定量化され、続いて水溶液 (31.74)、メタノール (24.25)、酢酸エチル (18.52) でした (図 4)。

F.cretica 粗抽出物とその合成 ZnO NP の総フラボノイド含有量。与えられた値は、3 回の平均値 ± 標準偏差として表されます。

フリーラジカル消去活性は、粗抽出物と比較してナノ粒子で最も高かった。ナノ粒子の場合、n-ヘキサンが IC50 値 36.74 で最も有望な活性を示し、次に酢酸エチル (IC50 = 35.10)、メタノール ((IC50 = 40.21))、水溶液 ((IC50 = 43.84) でした。粗抽出物は最小のフリーラジカルを示しました掃気活動（図5）。

ZnO NP と F. cretica の粗抽出物の抗酸化活性の比較分析。与えられた値は、3 回の平均値 ± 標準偏差として表されます。

F.cretica (地上部) 粗抽出物と合成 ZnO NP の抗菌能力を、さまざまな細菌株に対するディスク拡散法を使用して評価しました。粗抽出物では、メタノール抽出物で最大の活性が観察されました。すなわち、肺炎桿菌に対しては 14 ± 0.31 (MIC = 100 μg/ml)、大腸菌に対しては 12 ± 0.25 (MIC = 100 μg/ml)、および 12 ± 0.17 (MIC) = 100 μg/ml) 枯草菌に対して。続いて水性、すなわち枯草菌に対して13±0.27(MIC = 100μg/ml)であった。黄色ブドウ球菌、緑膿菌に対する活性は全く観察されないか、またはほとんど観察されなかった。ナノ粒子の場合、メタノールによってかなりの抗菌活性が示されました。すなわち、肺炎桿菌に対して 18 ± 0.19 (MIC = 33.3)、大腸菌に対して 16 ± 0.23 (MIC = 100 μg/ml)、および 21 ± 0.40 (MIC = 3.7 μg/ml) ml）枯草菌に対する。これに水性が続き、すなわち、肺炎桿菌に対して15±0.28(MIC = 100μg/ml)、枯草菌に対して13±0.19(MIC = 100μg/ml)であった。 n-ヘキサンは、肺炎桿菌 12 ± 0.25 (MIC = 100) および大腸菌 12 ± 0.17 (MIC = 100 μg/ml) に対して抗菌活性を示し、続いて酢酸エチル 12 ± 0.31 (MIC = 100 μg/ml) を示しました。）枯草菌に対する耐性（表２）（図６）。

F. cretica の抗菌活性 (A) ナノ粒子 (B) 粗抽出物。

F. cretica (地上部) 粗抽出物とナノ粒子の抗真菌能をディスク拡散法により評価しました。粗抽出物では、メタノール抽出物により、A.フラバスに対して11±0.21mmの穏やかな活性が示された。 F. solani に対する活性が最も低いことは、極性溶媒の粗抽出物によって示されました。 A. フミガタスおよびムコールに対する活性は観察されませんでした。ナノ粒子の場合、A. フラバス (15 ± 0.40 mm) および F. ソラニ (12 ± 0.31 mm) に対する極性溶媒抽出媒介 ZnO NP、つまりメタノールによって最大の活性が示されました。続いて水抽出を行った。それぞれ A.flavus (13 ± 0.27 mm) および F.solani (9 ± 0.19 mm) に対して。 A.フミガタスおよびムコールに対して活性は観察されなかった(表3)。

細胞毒性アッセイは、ブラインシュリンプ幼生に対する F. cretica (地上部) 粗抽出物とナノ粒子を使用して実施されました。 ZnO NP と比較して、粗抽出物では顕著な細胞毒性効果が観察されました。 n-ヘキサン抽出物は、LC50 値 72.92 μg/ml の酢酸エチルと比較して、LC50 値 44.52 μg/ml でより効果的でした。メタノールおよび水性抽出物は、LC50 値が約 200 μg/ml の最小活性を示しました。 ZnO NP の場合、n-ヘキサン抽出物媒介 ZnO NP の LC50 値は 42.41 μg/ml でより活性であることが判明し、続いて酢酸エチル抽出物媒介 ZnO NP の LC50 値は 62.45 μg/ml でした。メタノール抽出物媒介 ZnO NP (LC50:140 μg/ml) および水抽出物媒介 ZnO NP (約 200 μg/ml) は最小の活性を示しました (表 4)。

粗抽出物のうち、メタノール抽出物 (10 mm) には阻害の脱毛帯が観察されました。酢酸エチル抽出物は阻害を示さなかった(NA)が、n-ヘキサンおよび水性抽出物は透明なゾーン、すなわちそれぞれ6および7mmを示した。中程度のプロテインキナーゼ阻害がナノ粒子によって示された。最大の抑制ゾーンはメタノール抽出物媒介 ZnO NP (15 mm)、続いて水抽出物媒介 ZnO NP (11 mm)、n-ヘキサン抽出媒介 ZnO NP (9 mm)、および酢酸エチル抽出媒介 ZnO NP (9 mm) で観察されました。 mm）（図7、表5）。

F. cretica 粗抽出物とその ZnO ナノ粒子のプロテインキナーゼ阻害活性。 α-アミラーゼ阻害活性。

抗糖尿病活性を評価するために、F. cretica (地上部) の粗抽出物とナノ粒子を使用して、α-アミラーゼ阻害アッセイを実施しました。粗抽出物の中で、メタノールを使用して得られた抽出物（45.06 ± 0.19%）が最も高い活性を示し、続いて酢酸エチル（40.88 ± 0.34%）、n-ヘキサン（32.90 ± 0.29%）、水性抽出物（38.57 ± 0.21%）でした。それぞれ粗抽出物。これらの抽出物から得られた ZnO ナノ粒子は、粗抽出物とは異なる結果を示し、メタノール抽出物を介した ZnO NP で最大の活性が示されました (52.61 ± 0.36%)。これに、酢酸エチル抽出物媒介 ZnO NP (49.60 ± 0.13%)、n-ヘキサン抽出物媒介 ZnO NP (50.22 ± 0.15%)、および水抽出物媒介 ZnO NP (40.53 ± 0.32%) が続きました (図 8)。

F. cretica 粗抽出物とその ZnO ナノ粒子の α-アミラーゼ阻害能。与えられた値は、3 回の平均値 ± 標準偏差として表されます。

歴史を通じて、伝統医学は世界中で優先されるプライマリヘルスケアシステムであると考えられています。世界の総人口の約 60%、発展途上国の約 80% が、基本的な医療システムとして薬用植物に依存しています。漢方薬は、入手しやすさ、有効性、手頃な価格などの理由により重要性を増しています24。薬用植物の治療的価値は、生物活性のある植物化学成分の存在により比較的高いです。幸いなことに、自然はパキスタンに豊かな植物相と、約 6000 種の高等植物の成長を支える多様な気候条件を与えてくれました。植物種の 12.5 パーセントに薬効があることが報告されており、その数は天然物に対する地元の研究者の関心に基づいて増え続けています6。

ナノ粒子、特に金属ナノ粒子は、医療、エレクトロニクス、診断、フォトニクス、環境、農業などのさまざまな分野で注目を集めています。物理的および化学的アプローチによるナノ粒子合成は、環境毒性を引き起こし、発がん性を誘発するリスクが高い化学物質の有毒な使用にさらされます25。効果的な方法として生物学的実体を使用したナノ粒子の合成。薬効のある微生物や植物を利用することで重要性が増しました。しかし、ZnO NP を合成するための環境に優しいアプローチは、毒性がなく、コストが削減され、生体適合性があります 26。 ZnO NP は、生物学的および医療用途だけでなく、いくつかの市販製品でも広く使用されています27。

ファゴニアクレティカは一般に「ダーマサ」として知られており、よく知られた薬効を持っています。対象の植物は、発熱、歯痛、喘息、疥癬、胃疾患、腫瘍、および尿排出物に対して効果的であることが判明し28、抗菌、抗炎症、抗出血、血栓溶解および抗酸化特性についても報告されている9。 F.cretica 植物抽出物を使用した亜鉛ナノ粒子の合成に関して利用できるデータは非常に限られています。

本研究では、F.cretica 抽出物 (地上部分) を使用して ZnO NP を初めて合成しました。色の変化、つまりオフホワイトへの変化は、ZnO NP の合成を示しました。 UV および SEM により、合成されたナノ粒子の特性を評価しました。 UV-Vis 分光法をナノ粒子の形状と長さの検査に使用できることが報告されています 29。 ZnO NP の吸収ピークは、ZnO ナノ粒子の特徴である 350 ～ 400 nm の間に観察されました。 SEM 分析を使用して、ZnO NP の形態学的属性を決定しました。 SEM 分析により、微細で透明な ZnO NP の形成と、形状および粒子サイズが 65 ～ 80 nm の範囲の球状の粒子の凝集が明らかになりました。これらの結果は、ZnO NP の植物ベースの合成に関する以前の報告 30 および 31 と一致しています。

植物化学物質は、いくつかの変性異常の治療に非常に重要です 32。 F. cretica (地上部) 粗抽出物およびナノ粒子の植物化学分析および生物活性の結果から、ナノ粒子と比較して n-ヘキサン粗抽出物中に高レベルのフラボノイドが検出されることが明らかになりました (図 3)。最高の TFC 値は、ZnO NP と比較して、粗水抽出物で測定されました (図 4)。本研究の結果は 33,34 によって裏付けられています。

DPPH フリーラジカル消去活性の結果から、酢酸エチル抽出物から合成したナノ粒子は、粗抽出物と比較して最大の消去活性、つまり 67.79%、IC50 35.10 μg/ml (図 4) を示したことが明らかになりました。粗抽出物は、最適化された濃度では顕著なフリーラジカル消去能力を示すことができませんでした。同様の結果が、異なる植物種の NP を使用した際に観察されました 35、36、37、38、39、40。

F.cretica 粗抽出物およびナノ粒子の抗糖尿病活性をスクリーニングするために、α-アミラーゼ阻害アッセイを実施しました。 α-アミラーゼ阻害アッセイの結果は、メタノール抽出物のナノ粒子が粗抽出物と比較して52%阻害という高いα-アミラーゼ阻害活性を示すことを示した(図8)。亜鉛はインスリン作用と炭水化物代謝において重要な役割を果たします。さらに、植物から合成された ZnO NP の抗糖尿病活性も、ナノ粒子で抗糖尿病活性の増加を発見した 41 人によって報告されています。 F.cretica の粗抽出物と合成 ZnO ナノ粒子もプロテインキナーゼ阻害能についてスクリーニングされました。結果は、メタノール抽出物から合成されたナノ粒子が、粗抽出物と比較して顕著な阻害の脱毛帯を示すことを示した(表5、図7)。 ZnO ナノ粒子の抗がん活性は植物においてすでに報告されています 42。

肺炎桿菌、大腸菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌に対する抗菌活性が評価されています。 12 mm 以上の有意なゾーンを示したサンプルは、MIC 測定の対象となりました。本研究結果は、NPが肺炎桿菌および枯草菌に対して潜在的な抗菌活性を示すことを示した(表2、図6)。私たちの結果は、以前に報告された 42 の結果と一致しています。粗植物抽出物と合成ナノ粒子の抗真菌活性を評価しました。 A. フラバス、A フミガタス、ムコール、および F.ソラニに対する抗真菌活性を調査しました。結果は、極性溶媒抽出物から合成された ZnO ナノ粒子が、粗抽出物と比較して、A. フラバスおよび F. ソラニに対して顕著な抗真菌活性を示すことを示しました (表 3)。これらの発見は、非極性溶媒からの植物抽出物が極性抽出物と比較して強い抗菌力を示すという主張とは対照的です43。さまざまな植物からの ZnO NP の抗真菌活性は広く報告されています 42,44。

ブラインシュリンプ致死アッセイは、植物抽出物の安全性と毒性プロファイルを評価し、またそれらの薬理活性を決定するための効果的な方法と考えられています 45。 F. cretica 粗抽出物および合成ナノ粒子の細胞毒性効果は、n-ヘキサンから合成されたナノ粒子が粗抽出物と比較して実質的な細胞毒性効果を示すことを示した(表 4)。これらの結果は、46 によるさまざまな緑色合成ナノ粒子に関する同様の研究によって裏付けられています。

新鮮な植物はパキスタンのパンジャブ州から収集されました。イスラマバードのクエイド・イ・アザム大学植物科学部の専門分類学者ムシュタク・アハマド教授は、この植物をファゴニア・クレティカ（Fagonia cretica）と認定し、その標本は将来の参照のために同学部の植物標本館に保存されている（ACC 543220）。地上部分を分離し、洗浄して破片を取り除き、日陰で乾燥させた。これらの乾燥部分を乳棒と乳鉢で粉砕した。微粉末はさらなる使用のために別に保管された。

脱水した F. cretica 地上部の抽出物は、47 で説明されているように、簡略化された浸軟プロセスを通じて配合されました。非極性から極性範囲までの 4 つの溶媒、つまり n-ヘキサン (nH)、酢酸エチル (EA)、メタノール (MeOH)、および水性 (Aq) を使用しました。植物粉末１００ｇを各溶媒６００ｍｌに３日間浸漬した。浸した植物材料を 25 kHz の周波数で定期的に超音波処理しました。一定時間経過後、濾過を行い、同じ溶媒で再抽出を行った。ロータリーエバポレーターを使用して、それぞれの溶媒からのすべての濾液を混合し、放置して乾燥させた。これらの粗抽出物を完全に乾燥させた後、-80 °C で保存しました。同様の手順を各溶媒に採用しました。

ZnO NP は、48 の方法論をわずかに変更して利用することによって合成されました。植物抽出物 (50 ml) をビーカー内のホットプレート上で 50 ～ 60 °C まで 30 ～ 40 分間加熱し、5 g の 0.01 M 酢酸亜鉛溶液 (Sigma-Aldrich) を加熱抽出物に直接添加しました。混合物をホットプレート上で50〜60℃で2時間絶えず撹拌しました。２時間後に色の変化が観察され、これはＺｎＯＮＰの合成を視覚的に確認した最初のものであり、抽出物を放冷した。抽出物をペトリ皿に移し、非常に薄い層として広げました。プレートを 60 °C の乾燥オーブンで一晩放置して乾燥させました。細かく乾燥した粉末は、特性評価手順の準備が整いました。各抽出物について同じプロセスを繰り返しました。

UV-Vis 分光法は、ナノ粒子の特性評価に広く利用されている方法です 49。ランバート・ビールの法則50に準拠しています。酸化亜鉛ナノ粒子の特性評価は、350 ～ 400 nm の波長を使用して行われました。材料は分光器を使用して検査され、スペクトルは 300 ～ 700 nm の間で 1 nm の分解能で監視されました。

SEM (KYKY-EM6900) 検査は、ナノ粒子の形状とサイズをマイクロメートルからナノメートルレベルで検査するために利用されました51。酸化亜鉛ナノ粒子は、カーボンで均一に覆われたグリッド上にサンプル溶液の液滴を置き、水銀灯の下で 30 kV で 15 分間脱水することによって評価されました。調べて写真を撮りました。最後に、この機器にはナノ粒子の存在を確認するためのエネルギー分散スペクトル (EDS) が装備されました。

完全なフラボノイド濃度は、52 の方法に従って評価されました。抽出物/サンプル (20 μl) を、96 ウェルプレート内で 10 μl 酢酸カリウム、10 μl 塩化アルミニウム、および 160 μl の蒸留水と混合しました。続いて、この混合物を室温で３０分間インキュベートした。吸光度はマイクロプレートリーダーで405nmの波長で観察されました。ケルセチンと同等の総フラボノイド濃度を評価するために、2.5 ～ 40 µg/ml の値のケルセチン溶液を使用して標準曲線を作成しました。 20μlの各溶媒をネガティブコントロールとして使用した。

Folin-Ciocalteu 試薬を利用して、完全なフェノール含量が 52 の方法に従って測定されました。植物抽出物および標準溶液は、1 mg/μl の濃度で作成されました。 200 μl の一部を、十分に撹拌した 90 μl の Folin-Ciocalteu 試薬とともに 96 ウェルプレートにロードしました。溶液を室温で5分間インキュベートした後、90μlの炭酸ナトリウムを加え、プレートシェーカーを使用して完全に混合した。次に、この得られた混合物を室温で 60 分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを使用して 630 nm の波長で測定しました。標準検量線のプロットには没食子酸 (3.125 ～ 25 μg/μl) を使用しました。総フェノール含量を表すために、没食子酸当量を重量パーセントで使用した。陰性対照として、20μlのそれぞれの溶媒を使用した。

F. cretica の以下の生物活性を実行しました。

ディスク拡散技術は、53 で説明されているように、in vitro で各試験抽出物の抗菌特性を分析するために使用されました。 5 つの細菌株、つまり 2 つのグラム陽性菌、すなわち黄色ブドウ球菌 (ATCC 6538) および枯草菌 (ATCC 6633)、および 3 つのグラム陰性細菌、すなわち緑膿菌 (ATCC-15442)、大腸菌 (ATCC 15224)、および肺炎桿菌(ATCC-1705) は、植物抽出物の抗菌活性を分析するために使用されました。栄養寒天プレート上に、播種密度 1×106 CFU/ml の細菌株の新鮮培養物を使用して細菌叢を作成しました。各試験抽出物（DMSO 1 ミリリットルあたり 20 mg から 5 μl）を滅菌濾紙ディスクに含浸させ、セファキシムおよびロキシスロマイシン（DMSO 1 ミリリットルあたり 4 mg から 5 μl）を陽性対照として、DMSO（5 μl）を陰性対照として使用しました。。 37℃で24時間インキュベートした後、これらのディスクを適切にラベルを付けた播種寒天プレート上に置き、各ディスクの周囲の阻害ゾーンを測定によって決定しました。このテストは 3 回実行され、平均値が標準偏差から求められました。

MIC は、53 によって記載された技術を使用して取得されました。顕著な阻害ゾーン、つまり 12 mm を持つサンプルの MIC は、マイクロブロス希釈技術を使用して決定されました。各菌株の細菌接種材料は、事前に調整された密度（5104 CFU/ml）を使用して作成されました。 96 ウェルプレートで、栄養ブロスを利用して、各実験サンプルの 3 倍連続希釈を、最終濃度 100、33.33、11.11、および 3.70 μg/ml まで行いました。細菌培養物をブロス培養物中で11時間再水和し、その後冷蔵庫内で4℃に保った。

抗真菌性試験は、53の記載に従って実施した。アスペルギルスフミガタス (FFBP 66)、ムコール種 (FFBP 0300)、フザリウムソラニ (FFBP 0291)、およびアスペルギルスフラビス (FFBP 0064) のすべての抗真菌活性が試験されました。すべての真菌株は 6.5 パーセント SDA (サブローデキストロース寒天、pH 5.7) 上で 28 °C で培養し、その後 4 °C で冷蔵庫に保存しました。標準治療はクロトリマゾール (4 mg/ml) でしたが、陰性対照は DMSO でした。２５ｍｌの培地を保持するＳＤＡプレートを、新しくした１００μｌの真菌接種材料で感染させた。播種したSDAプレート上に、試験抽出物(5μl、20mg/ml DMSO)、DMSO(5μl)、およびクロトリマゾール(5μl、4mg/ml DMSO)を含む滅菌濾紙ディスクを挿入した。これらの接種したプレートを 30 °C で 24 時間インキュベートし、各ディスクの周囲の阻害ゾーンをミリメートル (mm) 単位で計算しました。

塩水を供給された狭い長方形の鍋 (22 × 32 cm) の中で、ブラインシュリンプ (Artemia salina) の卵 (Sera、ハイデルベルク、ドイツ) が産卵されました。 2 つの凹凸を形成するために、いくつかの穴が開いた 2 mm のプラスチックセパレーターをパンの内側に置きました。卵 (約 25 mg) を大きい方のセクション内に分散させ、アルミホイルで日陰を作り、他のセクションを照明しました。光屈性ノープリウス（ブラインシュリンプの幼生）は、羽化後にセパレーターを通して殻から剥がした後、光が当たる側からピペットで採取した。

細胞毒性実験は、異なるアルファベット (A ～ H) の 96 ウェルプレートで実施されました。マイクロウェルプレートのウェルAとウェルEに44μlの海水を注ぎました。海水 25 マイクロリットルを B、CD、F、G、H に注ぎ、サンプル 6 μl を A と E に注ぎました。サンプル 25 μl を A から採取してウェル B に注ぎ、ウェル B からは 25 μl を注ぎました。 μlをウェルCに加え、同じプロセスをDに対して繰り返し、Dからの25μlを廃棄した。これは、均一な希釈値を確保するために行われました。同じ手順を E、F、G、H と H から廃棄まで繰り返しました。 10 匹のエビをマイクロプレートの各ウェルに移し、すべてのウェルに 300 μl の海水を加えて定量を完了し、24 時間保持しました。幼虫の生存を顕微鏡で観察した。試験は 3 回行われ、アボット法を使用して死亡した幼虫の割合が計算されました。

2,2,ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル (DPPH) テストを使用して、フリーラジカル消去特性を測定しました。 DPPH フリーラジカルテストは、52 の方法論を使用して実行されました。９．６ｍｇのＤＰＰＨを１００ｍｌのメタノールに溶解してＤＰＰＨ溶液を作製した。試験サンプルは、ジメチルスルホキシド中で 1 ミリリットルあたり 4 mg として調製されました。標準アスコルビン酸は、DMSO中で1 mg/mlとして生成されました。 96 ウェルプレートの各ウェルに、190 μl の DPPH 試薬とともに、10 μl の試験物質のアリコートを導入しました。続いて混合物を撹拌し、光のないところで３７℃で１時間インキュベートした。 ELISAプレートリーダーにより515nmでの吸光度を計算した。 DMSO をネガティブコントロールとして使用し、アスコルビン酸 (ASA) をポジティブコントロールとして使用しました。実験は、表曲線ソフトウェアを使用して導出されたIC50値を用いて各試験サンプルに対して3回繰り返され、阻害率は次の方程式を使用して計算された。

どこ; 「Ac」はネガティブコントロールの吸光度、「As」は実験サンプルの吸光度です。

このアッセイでは、54 で指定された方法論に従って、Streptomyces 85E の精製株で菌糸形成が観察されました。新鮮なストレプトマイセス培養物からの胞子（菌糸体断片）を、限定された ISP4 培地を含む滅菌プレート上に分配することにより、細菌叢が培養されました。滅菌した 6 mm 濾紙ディスク上に、各抽出物 (ジメチルスルホキシド 1 ミリリットルあたり 20 mg) を約 5 μl 注ぎました。含浸させた紙ディスクを、ディスクあたり 100 μg のピーク比で Streptomyces 85E を接種したプレートの上部に直接置きました。ジメチルスルホキシドおよびサーファクチンを注入したディスクを、それぞれ陰性および陽性対照として使用した。これらのプレートを 30 °C で 3 日間インキュベートし (これは、Streptomyces 85E が菌糸を生成するのにかかる時間です)、結果をサンプルおよびコントロールが挿入されたディスクの周囲の脱毛阻害ゾーンとして評価しました。

サンプル抽出物の抗糖尿病能力は、標準的なα-アミラーゼ阻害アッセイに若干の変更を加えて評価されました55。 96 ウェルプレートに、25 μl のアミラーゼ (0.14 U/ml)、150 μl のリン酸緩衝液 (pH 6.8)、40 μl のデンプン溶液 (リン酸カリウム緩衝液中 2 mg/リットル)、および 10 μl を含む反応混合物を入れます。サンプル (1 ミリリットルあたり 4 mg のジメチルスルホキシド) を 50 °C で 30 分間インキュベートした後、1 モルの塩酸溶液 20 μl で阻害しました。この後、個々のウェルを90μlのヨウ素溶液(5mMヨウ素、5mMヨウ化カリウム)で満たした。ネガティブコントロールには植物抽出物は含まれていませんでしたが、ブランクはアミラーゼと植物抽出物を含まずに作成され、両方が同量の緩衝液で置き換えられました。陽性対照として、250μMのアカルボースを使用した。インキュベート後、この反応プレートの吸光度を 540 nm で評価しました。性能は、乾燥抽出物ミリグラムあたりのα-アミラーゼ阻害パーセントで測定されました。その後、次の式を使用して決定されました。

ここで、Ob = ブランクウェルの吸光度、Os = サンプルの吸光度、および On = ネガティブコントロールの吸光度。

この論文には倫理的配慮は適用されません。

植物材料の収集を含む植物に関する実験研究は、関連する制度的、国内的、国際的なガイドラインおよび法律に準拠しました。

適用できない。

本研究は、Fagonia cretica 抽出物を使用した ZnO ナノ粒子の簡単かつ成功した合成を報告しました。得られたナノ粒子は、紫外可視分光法と走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して特性評価されました。紫外可視スペクトルは、350 ～ 400 nm の範囲の ZnO ナノ粒子の特徴的なピークを示しました。 SEM 分析により、ナノ粒子は外観が球形で、粒子寸法が 65 ～ 80 nm の範囲であることが明らかになりました。本研究の結果、純粋な植物抽出物の植物化学物質（フェノールとフラボノイド）含有量は、合成されたナノ粒子の含有量よりも高いことが明らかになりました。さらに、この研究は、F. cretica 抽出物から合成された ZnO ナノ粒子が、強力な抗菌、抗真菌、抗酸化、抗腫瘍、抗糖尿病、および細胞毒性活性を示すことを実証しています。植物（濃縮された薬理活性化合物）を利用して合成された生体適合性ナノ粒子は、医薬品、標的薬物送達、食品、化粧品、農業などのナノ医療として多様な用途があり、生物医学研究の主要な候補となっています。結論として、実施された研究の結果は、民族医学的に価値のあるF. indicaから合成された環境に優しいZnO NPが、酸化ストレス、感染症に関連する異常の治療、および抗糖尿病薬として生物医学的に使用できる可能性があることを示しています。新薬を発見するために、この植物の活性化合物の単離に関するさらなる研究が計画される可能性があります。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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研究者らは、このプロジェクトの出版に資金を提供してくれたカシム大学科学研究部長に感謝したいと思います。

この研究は、公共、商業、非営利部門の資金提供機関から特別な助成金を受けていません。

国際イスラム大学イスラマバード基礎応用科学部生物科学部（女性キャンパス）、イスラマバード、44000、パキスタン

ブシュラ・ハフィーズ・キアニ & フィッツァ・イクラム

クエイド・イ・アザム大学生物科学部薬学部、イスラマバード、45320、パキスタン

ウマイラ・ファティマ、イサン・ウル・ハク、トフィーク・ウル・レーマン

カシム大学理学部物理学科、ブライダー、51452、サウジアラビア

アイエシャ・アルホダイブ

カシム大学、ブライダー、51452、サウジアラビア、生物学部門、科学ユニット、教育学部長職

イファット・ナズ

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著者全員がこの研究の構想と設計に貢献しました。 BHK がこの研究を監督、考案、設計しました。資料の準備、データ収集、分析、原稿執筆は、BHK、FI、IH、AA、HF、IN、TR によって実行されました。すべての著者が最終原稿を読み、校正し、承認しました。

ブシュラ・ハフィーズ・キアニまたはアイエシャー・アルホダイブへの通信。

著者は競合する利益を宣言していません。この原稿はオリジナルであり、他のジャーナルへの出版の可能性のために投稿されておらず、他の場所で出版されていません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Kiani、B.、Ikram、F.、Fatima、H. 他。 Fagonia cretica 抽出物を使用した亜鉛ナノ粒子の生物医学および植物化学的応用の比較評価。 Sci Rep 12、10024 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-14193-y

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受信日: 2022 年 3 月 4 日

受理日: 2022 年 6 月 2 日

公開日: 2022 年 6 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14193-y

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Fagonia cretica 抽出物を使用した亜鉛ナノ粒子の生物医学および植物化学的応用の比較評価