鞭毛内輸送複合体IFTの構造的洞察

Nature Communications volume 14、記事番号: 1506 (2023) この記事を引用

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鞭毛内輸送 (IFT) トレインは、2 つのマルチサブユニット複合体、IFT-A および IFT-B で構成されるポリマーであり、繊毛の生合成とシグナル伝達に不可欠な繊毛内で双方向の細胞内輸送を実行します。 IFT-A は、膜タンパク質の繊毛による輸入と逆行性の貨物輸送において重要な役割を果たします。 しかし、IFT-Aの分子構造と、生体内でのIFT-AのIFTトレインへの組み立て機構は依然として解明されていない。 今回我々は、原生動物テトラヒメナ・サーモフィラのIFT-A複合体の低温電子顕微鏡構造を報告する。 IFT-A 複合体は、伸長状態と折りたたまれた 2 つの異なる状態を示すことがわかりました。 注目すべきことに、順行性 IFT トレインのその場クライオ電子断層撮影構造との比較により、順行性 IFT トレインに組み込まれた場合の apo IFT-A のフレキシブル アームの一連の調整が明らかになります。 私たちの結果は、IFT-A の複雑な原子分解能モデルと、前行性 IFT トレインの組み立てメカニズムに関する貴重な洞察を提供します。

繊毛は、細胞表面から突き出て、さまざまな役割を果たす高度に保存された細胞小器官です1。 繊毛の機能不全は、視力障害、腎機能不全、男性不妊症などを伴う繊毛病と呼ばれる多くのヒトの病気を引き起こします2。 鞭毛内輸送 (IFT) 機構は、繊毛の組み立てと維持、および繊毛内外への貨物の送達によるシグナル伝達に不可欠です 3,4。

各 IFT トレインは、分子量がそれぞれ約 0.8 MDa と 1 MDa の 2 つの大きな複合体 IFT-A と IFT-B のポリマーです5。 IFT-B複合体は、10サブユニットのコアサブ複合体IFT-B1と6サブユニットの周辺サブ複合体IFT-B2で構成され、微小管モーターキネシン-26,7によって駆動される毛様体タンパク質の順行性輸送（先端に向かう）を媒介します。 8. IFT-A 複合体は 6 つのサブユニット (IFT144、IFT140、IFT122、IFT121、IFT139、および IFT43) で構成され、ダイニン 1b によって駆動される逆行性輸送 (塩基に向かう) と、腸管全体にわたるさまざまな膜タンパク質の毛様体輸入の両方を仲介します。毛様体門9、10、11、12、13、14。 クラミドモナス・ラインハルティの順行性列のその場クライオ電子断層撮影法 (cryo-ET) 研究により、順行性列には IFT-A と軸糸の間にある背骨として IFT-B が密に詰まっており、IFT-A は直接位置していることが明らかになりました。毛様体膜の下15． 毛様体先端に到達した後、順行性列は完全に異なるジグザグの逆行性列に改造され、キネシン-2 の不活性化、ダイニン-1b の活性化、積荷の放出などの複数のイベントを調整します15、16、17、18、19、20。 IFT-A の欠陥または濃度の低下により、逆行性輸送の速度が低下し、繊毛が短くなり、毛様体先端での IFT-B の蓄積が起こります 21、22、23、24、25。 IFT-A 遺伝子の変異は、骨格、腎臓、目に関連する疾患を含む多数の繊毛症を引き起こしました 2,26。 高解像度の IFT-A 構造の欠如は、IFT-A の IFT トレインへの集合メカニズムや、毛様体輸送と繊毛病の分子基盤の理解を大きく妨げます。

最近、いくつかの研究で、高解像度クライオ電子顕微鏡 (クライオ EM) IFT-A 構造と、順行 IFT トレインの 20.7 Å の in-situ クライオ ET モデルが報告されました 27、28、29、30。 今回、我々は原生動物テトラヒメナ・サーモフィラからIFT-A複合体を精製し、3.6～8.8Åの分解能範囲でIFT-A複合体とそのサブアセンブリのクライオEM構造を決定した。 これらの構造の分析により、アポ IFT-A 複合体は 2 つの剛構造モジュール、頭部モジュールと基部モジュールで構成され、溶液中で 2 つの異なる伸長状態と折り畳み状態を提示することが明らかになりました。後者は最近の IFT-A では同定されていませんでした。構造研究27,28,29,30,31。 さらに、IFT-Aは、apo IFT-Aのフレキシブルアームの一連の調整を介して前行性IFTトレインに組み込まれることがわかりました。 これらの結果を総合すると、IFT トレインの構築メカニズムに関する理解が大幅に広がり、ヒトにおける疾患関連 IFT-A 変異体の病因についての構造的洞察が得られます。

IFT-A複合体の構築機構を理解するために、カルボキシル末端にFlagとプロテインAタグを付加したテトラヒメナ・サーモフィラのIFT122-FZZ株を作製しました。 2 段階のアフィニティー精製スキームを使用して、内因性テトラヒメナ IFT-A 複合体を濃縮しました。 次に、精製された複合体をSDS-PAGEおよび質量分析に供し、IFT-Aの6つの成分すべての存在を確認しました（図1a、b、補足図1aおよび補足データ1）。 驚くべきことに、ネイティブPAGE画像では、IFT-Aの2つの別々のスミアバンドが明らかになりました。これは、この高度に精製された複合体が、不均一な低速移動状態とより均質な高速移動状態の2つの主要な立体構造を採用していることを示唆しています（図1b）。 ネガティブ染色データの二次元分類により、アポIFT-A粒子は非常に柔軟性があり、ネイティブPAGE分析で捕捉さ​​れた低速および高速の移動状態に従って、伸長または折りたたまれた立体構造をとることが明らかになりました（図1b〜d） ）。

a IFT-A コンポーネントのドメイン組織。 IFT144、IFT140、IFT122N、IFT122C、IFT121、IFT139、IFT43 は、それぞれアキノキリンソウ、サーモン、緑、黄緑、ターコイズ、青、紫に色付けされています。 黒のアスタリスクは、IFT144、IFT140、IFT122、および IFT121 の 2 番目と 3 番目の TPR リピートの間に挿入されたヘリックスを示します。 ヘッド モジュール コンポーネントとベース モジュール コンポーネントの背景色は、それぞれ明るい黄色と淡い青色です。 AlphaFold-2 を使用して構築された IFT144WD1、IFT144C、IFT140C、および IFT139N のモデルは、破線の楕円または円で示されています。 IFT43 の中間の不規則ループは破線で示されています。 b 精製された IFT-A 複合体の純度および主要な立体構造を示す銀染色 SDS-PAGE ゲル (左) およびネイティブ PAGE ゲル (右)。 各実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。 c IFT-A 複合体の代表的なネガティブ染色画像。 粒子の 2 つの異なる構造は、それぞれ赤い四角形と円でマークされています。 d IFT-A複合体のネガティブ染色画像の2Dクラス平均。 2 つの直交するビューでの伸長 (e) および折り畳まれた (f) IFT-A 複合体のクライオ EM 密度マップ。 ヘッドモジュールはライトイエロー、ベースモジュールは淡いブルーに着色されています。 g 伸長状態から折り畳み状態へのヘッドモジュールの構造変化を示す模式図。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

テトラヒメナ IFT-A のクライオ EM 構造を決定するために、ガラス化氷中の 66,729 個の生の IFT-A 粒子画像を収集しました（補足図 1b）。 サブ分類により、それぞれ8.5Åと8.8Åの解像度で伸長および折り畳まれたIFT-A複合体の密度マップを生成する粒子の2つの異なるクラスを取得することができました（図1e、fおよび補足図2、3）。 。 これら 2 つのマップの比較分析により、IFT-A は同様のサイズの 2 つの剛体モジュールで構成されていることが明らかになりました。これ以降、これらを IFT-A のヘッドモジュールとベースモジュールと呼びます（図 1e、f）。 細長い複合体では、ヘッドモジュールとベースモジュールが隣接して、最長寸法が370Åを超えるスリムな「S」字型のアーキテクチャを形成します（図1e）。 まったく対照的に、折りたたまれた構造では、ヘッドモジュールは伸長状態の位置から剛体として約125°回転してベースモジュールに折り返され、アポIFT-A複合体の動的な性質を例示しています（図1e- g)。

IFT-A 複合体の構造を原子レベルで明らかにするために、局所的に焦点を当てた分類を採用して、ベース モジュールとヘッド モジュールの EM 密度マップを個別に改善しました。これにより、 AlphaFold-2 予測の補助 (補足図 2 ～ 5 および表 1)32。 IFT43を除いて、IFT-Aの5つの大きなコンポーネントにはすべて、複合体の全体的な骨格を構成する長い配列のテトラトリコペプチドリピート（TPR）が含まれています（図1aおよび補足図6）。 特に、IFT144、IFT140、IFT122、および IFT121 は、N 末端から C 末端まで同じドメイン組織を共有しており、2 つのタンデム WD40 β プロペラ (WD)、12 ～ 20 個の TPR のアレイを含み、IFT140 を除き、亜鉛結合ドメイン（ZBD）（図1a）。 これら 4 つのサブユニットは 2 つのモジュールに分散されています。 ヘッドモジュールは IFT140、IFT144、および IFT122 の C 末端半分 (IFT122C、706-1246) で構成され、ベースモジュールは IFT121、IFT122 の N 末端 (IFT122N、1-705)、および IFT139 で構成されます。 IFT43 (図 2a、b)。 興味深いことに、N 末端 WD40 プロペラは、ヘッド モジュール内の IFT140 と IFT144 の最初の 4 つの TPR とともに、疑似二重対称性によって組織されており、IFT140 の 2 番目と 3 番目の TPR の間に独特の α ヘリックスが挿入されています。そして、IFT144により、接合部のTPRが形状と静電相補的な方法の両方でジグザグ構成にロックされます（図1a、2cおよび補足図7a）。 同様の擬似二重対称構成は、ベースモジュールのIFT121-IFT122ヘテロダイマーにも見られ、IFT-Aの両方のモジュールでこの基本的な組織メカニズムが保存されていることを強調しています（図1a、2dおよび補足図7b）。 構造的重要性と一致して、ヒト IFT121、IFT122、IFT140、および IFT144 の最初の 4 つの TPR における単一のミスセンス変異または複合ヘテロ接合性変異は、頭蓋外胚葉異形成、レーベル先天性黒内障、短肋骨胸部形成不全を含む複数の繊毛症を引き起こします 33,34,35。 36.

ヘッド (a) モジュールとベース (b) モジュールの原子構造。 カラースキームが表示されます。 この漫画は、IFT-A の伸長状態におけるモジュールの相対位置を示しています。 擬似二重対称 IFT144-IFT140 (c) および IFT122-IFT121 ヘテロ二量体 (d)。 最初の 4 つの TPR によって形成される中央の TPR 接合部が黒い破線のボックスで強調表示されており、右側に拡大されています。 TPR には番号が付けられ、各サブユニットに挿入された α ヘリックスにはアスタリスクが付けられます。 e IFT122 を備えたヘッド モジュールの別の図を表面表現で示します。 f IFT122WD1 と IFT139C の間 (1)、IFT121WD1 と IFT43 の間 (2)、IFT121WD2 と IFT43 の間 (3)、および IFT43 と IFT139-IFT121-IFT122 の間 (4) のベースモジュール内の相互作用ネットワークの拡大図。

保存された擬似二重対称組織にも関わらず、ヘッドモジュールとベースモジュールは対照的な構造的特徴を示します。 ヘッドモジュールでは、IFT140 と IFT144 の両方の 2 番目の WD40 プロペラと最初の TPR の間の約 15 残基のリンカーが急激に回転し、IFT140 と IFT144 のプロペラが中央の擬似二重構造から離れて反対方向を向くようになります。軸は細長い構造をしています（図2a、c）。 IFT122のC末端ZBDは、IFT140-IFT144 TPR接合の反対側に取り付けられ、IFT140のTPRアレイによってさらに囲まれたコンパクトなコアを構成し、合計約2500Å2の溶媒露出表面積を埋めます（図2e） ）。 このコアから、ヘッドモジュールで最も可変のセグメントである IFT122、IFT140、および IFT144 の TPR アームが伸びています (補足図 3)。 ヒト IFT122ZBD の Tyr1077 におけるフレームシフト変異 (テトラミメナ IFT122ZBD の Lys1013 に相当) は、頭部モジュールのコアを破壊し、早期乳児死亡または頭蓋外胚葉異形成を伴う重度のビーマー・ランガー症候群を引き起こします 37。これは、頭部モジュールのコアの組織化における IFT122ZBD の重要な役割を強調しています。 IFT-A（図2e）。

ヘッドモジュールの細長い構造とは対照的に、ベースモジュールはコンパクトな構造を採用しています（図2b）。 IFT121、IFT122、およびIFT139は一緒に囲まれた楕円形のリングを形成し、IFT139のN末端TPR（IFT139N、1-694）はソレノイド構造で伸びています（図2b）。 WD40プロペラとIFT121およびIFT122のTPRの間の短いリンカー（約5残基）は、プロペラの位置をIFT121-IFT122 TPR接合部の真上に制約し、楕円形リングの半分を形成します（図2b）。 この構造は、IFT121とIFT122の間の広範な接触によって安定化され、ベースモジュールの溶媒にさらされた約3130Å2の表面積が埋められます（図2b、d）。 反対側では、IFT121のZBDがIFT139のTPRによって形成された螺旋状の溝に嵌まり、ベースリングの残りの半分を構成します（図2b）。 特に、ベースモジュールの楕円形リングは、IFT139のまさにC末端残基であるLys1334によって封止されており、その脂肪族側鎖はIFT122WD1の疎水性中央空洞に突き刺さっています（図2f）。 すべての生物においてIFT139の高度に保存されたリジンまたはアルギニンは、IFT-Aの基本モジュールの同様の閉鎖機構を示しています（補足図6c）。

ベースモジュールの顕著な特徴は、複合体の最小サブユニットであるIFT43が細長い構成を採用し、分子テザーとしてベースを横断してリング状の構造を安定化させることです（図2b、f、および補足図8）。 。 IFT43 の N 末端 (IFT43N) は、Trp9-Phe11 と Trp33 の芳香族側鎖がそれぞれ IFT121WD1 と IFT121WD2 の疎水性ポケットに深く埋め込まれた状態で、IFT121 の 2 つの WD の表面に沿って移動し、2 つのプロペラを固定方向にクランプします。ベースモジュール（図2f）。 特に、IFT43Nは、最近報告されたIFT-A構造では観察されませんでした27、28、29、30。 IFT43のC末端半分（IFT43C）は6つの別々のヘリックス（α1〜α6）に折りたたまれ、IFT121とIFT122の表面に沿って蛇行し、ベースモジュールの溶媒にアクセス可能な約3730Å2の表面積を埋めます（図2f）。 特に、ヘリックスα1〜α3はIFT121ZBDとIFT139の間の空いた領域を埋めますが、ヘリックスα4はIFT122WD2とIFT121ZBDによって形成された深い溝を占めます（図2f）。 IFT43 の喪失は、IFT-A の不安定性、さらには鞭毛の喪失をもたらします 14 。このことは、IFT-A の基本モジュールの組み立てにおける IFT43 の分子接着機能の重要性を強調しています。

アポ IFT-A のヘッド モジュールとベース モジュールの関係を明らかにするために、これらのモジュールの構造を細長く折りたたまれた IFT-A 密度マップに手動で調整して当てはめ、両方の IFT-A 複合体全体の原子モデルを生成します。状態（図3a）。 構造を比較すると、個々のヘッドモジュールとベースモジュールがこれらの2つの状態でほぼ同一であることがわかります（図3aおよび補足図9）。 細長い IFT-A 構造と折りたたまれた IFT-A 構造の最も顕著な違いは、サブユニット IFT122 にあり、その構造は 2 つのモジュールが 2 つの状態でどのように接続されるかを定義します (図 3a、b)。 伸長状態では、IFT122のTPRアレイはベースモジュールのIFT121-IFT122接合部から始まり、完全に伸長した状態でヘッドモジュールのコアに突き刺さります（図3b）。 まったく対照的に、TPR アレイは 4 番目と 5 番目の繰り返しの間で急激に曲がり、ヘッド モジュール全体が剛体としてベース上に折り返されます (図 3b)。 IFT122 の TPR リピート 4 と 5 の間の 11 残基ループ (ループ 45、残基 707 ～ 717) は伸長状態と折りたたまれた状態の両方で無秩序であり、柔軟性の高いヒンジとして機能し、IFT-A の大きな構造変化に対応します。 2 つの状態間の遷移 (図 3b および補足図 6b)。 特に、伸長状態の周囲の位置とは対照的に、折りたたまれた状態では、IFT140とIFT144の長いTPRアームはIFT140のWDとIFT121、IFT122、およびIFT139のTPRによって囲まれています（図3c）。 これらの密接な接触により、ヘッドモジュールとベースモジュールの間の溶媒がアクセス可能な表面積が約1000Å2埋まり、折り畳まれた状態が伸長された状態よりもエネルギー的に有利であることが示唆されます（図3c）。

a IFT-A の伸長状態 (左) と折りたたまれた状態 (右) の原子モデル。 IFT-A タンパク質は図 1a と同じ色で表示されます。 ベースモジュールの構造に基づいて、折りたたまれた状態が伸長した状態に重ねられ、ヘッドモジュールは灰色で表示されます。 b 2 つの状態における IFT122 の TPR アームの比較。 IFT122 は図 1a のように色付けされ、IFT-A の残りの部分は図 1e のように色付けされます。 2 つの状態における IFT122 の曲げ部位の重ね合わせ。 最初の 4 つの TPR は淡い青色に色付けされ、5 番目の TPR と Loop-45 は、それぞれ伸長状態では緑色に、折りたたまれた状態では薄緑色に色付けされます。 c 折り畳まれた状態 (左) と伸長状態 (右) のヘッド モジュールとベース モジュールの間のインターフェイス。 IFT140TPR と IFT144TPR は図 1a のように、IFT139TPR、IFT121TPR、IFT122TPR、IFT140WD は図 1e のように色付けされ、IFT-A の残りの部分は明るい灰色で表示されます。 d 伸びた状態と折りたたまれた状態にそれぞれ対応する 2 つのクラスターを示す、頭と基部の相対的な向きのプロット。 順行トレイン内の組み立てられた IFT-A の 2 つのモジュール間の相対的な向きは、赤いサイクルで示されます。 伸長状態での頭部の動きを示しています。

IFT-A複合体のヘッドモジュールとベースモジュールのダイナミクスをさらに調査するために、焦点を絞った再構成からの粒子の角度割り当てを使用して、2つのモジュール間の相対位置の範囲を計算しました。 この分析により、明確な特徴を持つ 2 つの主要なクラスの IFT-A 立体配座が明らかになりました（図 3d）​​。 最初のクラスは狭い角度分布を持つ折り畳まれた状態に対応しますが、2番目のクラスはより広い角度分布を持つ伸長状態であり、ヘッドモジュールとベースモジュールが互いに対して約30°曲がる可能性があります（図3dおよび補足）動画１）。 私たちは、クライオ EM 再構成によって捕らえられた伸長および折り畳まれた立体構造が、水溶液中の立体構造空間におけるアポ IFT 複合体の 2 つの局所エネルギー最小状態を表していると提案します。 対照的に、最近報告された他の IFT-A 構造では、局所的な変動を伴う細長い構造のみが確認されました 27、28、29、30。

アポ IFT-A 複合体の原子モデルは、IFT-A 複合体が重合を通じてどのように IFT トレインに組み込まれるかの分子基盤を理解するユニークな機会を提供します。 私たちは、IFT-A 構造を緑藻クラミドモナスの順行性 IFT トレインの 20.7 Å クライオ ET 密度マップに当てはめることに着手しました 27。 注目すべきことに、我々は、剛性ヘッドコアとベースコアがそれぞれ0.80と0.78という高い相互相関スコアで順行トレイン密度に個別に明確に適合できることを発見しました（図4a）。これは、アポIFT-Aが事前に形成された構造で存在することを示唆しています。列車に組み込む前のバイモジュール構造11、13、14、38。

a 順行列車のクライオ ET 密度マップへの IFT-A のフィッティング。 ヘッドコアとベースコアは図1eのように薄黄色と淡青色に色付けされており、伸長状態と組み立て状態のフレキシブルTPRはそれぞれピンクとオレンジ色に色付けされています。 b IFT121ZBD と IFT139N の間 (1)、IFT140WD と IFT121WD の間 (2)、IFT144TPR と IFT140TPR の間 (3-4)、および IFT144ZBD と IFT139N の間 (5) で形成された分子間相互作用を詳しく表示します。 c テトラヒメナ IFT-A とクラミドモナス IFT-B の原子モデルを順行列車マップに当てはめ、推定上の [IFT-A]-[IFT-B] 境界面を明らかにします。 IFT-Aはこの研究からのもので、図1aのように色付けされています。IFT-BはLaceyらからのものです。 IFT172 (残基 1 ～ 1104) はシアン、IFT88 (残基 122 ～ 690) は黄色、IFT74 (残基 135 ～ 340) はオレンジ、残りの IFT-B は薄茶色です。 微小管ダブレット（MTD）のEMDBコードはEMD-20631です。 IFT-B、ダイニン2モータードメイン、テールドメインのPDBコードはそれぞれ8BD7、6RLA、6RLBです。 d 順行列車の周期的配置。 1 つの周期単位内の 6 つの IFT-B、3 つの IFT-A、および 2 つの dynein-1b は c で色付けされ、残りは灰色で表示されます。

順行性IFTトレインのIFT-Aのヘッドモジュールとベースモジュール間の相対的な配向の計算により、順行性IFTトレインのIFT-Aは折りたたまれた状態よりも伸長した状態に似ていることが明らかになりました（図3d）。 伸長したアポIFT-Aは、一連の構造変化を介して、順行列車のクライオET密度マップにドッキングできます（図4aおよび補足ムービー2）。 まず、IFT139Nのねじれをわずかに締めることにより、このソレノイド構造が順行マップの下部の空いたボリュームにぴったりとフィットし、隣接するIFT-AからIFT121ZBDに接触することができます（図4a、bおよび補足図10）。 。 IFT139Nのこの調整により、順行性列において[-IFT139N-IFT121ZBD-]n繰り返しパターンでIFT-A複合体が重合します（図4a、b）。 一方、ヘッドコアは IFT122 のループ 45 ヒンジを中心に反時計回りに約 50°回転し、順行トレインの対応する位置に収まります。このとき、IFT140 の WD1 は -1 の位置で隣接する IFT121 の WD1 と接触します (図 2)。 4a、b)。 次に、IFT140 と IFT144 の両方のフレキシブル TPR アームが、IFT122 の中央 TPR アーム近くのクラスター位置からねじれて反対方向に伸び、+1 および +1 で隣接する IFT-A 複合体から IFT144 と IFT140 の TPR アームと結合します。それぞれ -1 位置（図 4a、b）。 このプロセスを繰り返すことにより、前行列車内で腕を組んで IFT-A のタンデム接続が確立されます (図 4a、b)。 驚くべきことに、列車内のIFT144ZBDは、-2の位置でIFT-A複合体からのIFT139Nとの接続も確立しており、順行列車のIFT-Aの構造単位が3つの連続した相互リンクされたIFT-A複合体から構成されていることを示唆しています（図4b） ）。 この観察と一致して、亜鉛イオン結合を破壊するヒト IFT144 の 2 つの変異、C1253Y および C1267Y (テトラヒメナ IFT144 の C1286 および C1300 に相当) は、腎盂炎およびジューヌ症候群を引き起こし、毛様体機能における IFT144ZBD の重要な役割を強調しています 39,40。 まとめると、順行性トレインにおけるこの重合した高度に相互接続された構成は、IFT-Aを完全に伸長した立体構造で安定化させますが、そうでない場合は、IFT-Aの伸長して折りたたまれたアポ状態と比較して好ましくありません（図4b）。

このモデルは、順行列車のラジカル方向からの 2 つの異なる IFT-A 表面を明らかにしました。 外表面には、繊毛膜に隣接し、さまざまな膜結合タンパク質の送達に重要な役割を果たす WD が豊富に含まれています (図 4c)9、41、42、43。 IFT-Aの反対側の内面は、IFT140、IFT144、およびIFT139からの凸型TPRクラスターによって特徴付けられます（図4cおよび補足図11）。 順行列車における IFT-A と IFT-B の間の相互作用についてさらに洞察を得るために、組み立てた IFT-A 構造と公開された IFT-B 構造を順行 IFT の複合マップにドッキングすることにより、擬似原子モデルを構築しました。電車（図４ｃ）２７． このモデルは、IFT-A と IFT-B の間の 3 つの推定接触領域、IFT140IFT-A-IFT172IFT-B、IFT144IFT-A-IFT88IFT-B、および IFT139IFT-A-IFT74/IFT81IFT-B を明らかにします (図 4c)。以前の生化学研究15、27、29、44、45、46、47と一致しています。 順行列車内の IFT-A のこの組み立て構成は、順行列車の構造単位が IFT-A、IFT-B、およびダイニン 1b の比率が 3:6:2 で構成されるという概念と一致しています (図.4d）15．

現在までに、IFT-A には 140 を超える病原性ミスセンス変異がヒト遺伝子変異データベース (HGMD、http://www.hgmd.cf.ac.uk/) に登録されています (補足図 6、12 および補足データ) 2)。 異なる生物間での IFT-A タンパク質の高度な配列保存により、ヒト IFT-A におけるミスセンス変異の発症メカニズムを調査することが可能になります (図 5)。 順行性トレインにおけるテトラヒメナ IFT-A 複合体の構造解析により、これらの疾患の原因となる変異が 4 つの異なるグループに分類できることが明らかになりました。 [IFT-A]-[IFT-A] アセンブリ界面での突然変異 (タイプ II)。 [IFT-A]-[IFT-B] アセンブリ界面での突然変異 (タイプ III)。 IFT-A複合体（タイプIV）内のコンポーネント界面での突然変異（図5および補足図12）。 すべてのIFT-A WDが繊毛膜に直接面していることを考えると、WDのI型変異の大部分は、WDの折り畳みおよび/または安定性を損なうことにより、直接的または間接的に貨物輸送に悪影響を及ぼしている可能性があります（図4cおよび5）。 。 対照的に、タイプIIおよびタイプIIIの界面での突然変異は、順行性IFTトレインへのIFT-Aの重合を妨げます（図4c、5および補足図12）。一方、タイプIVの突然変異はIFTの不安定性を引き起こします。 -複合体（図2a、b、および5）。 特に、すべてのIII型変異体はIFT144CまたはIFT139Nのいずれかに位置しており、IFT144とIFT139の両方がIFT-AとIFT-Bの間の界面にあるという観察と一致しています（補足図12）。 興味深いことに、ヒト IFT139 は、IFT-A の周縁部に位置し、WD を欠いているにもかかわらず、すべての IFT-A タンパク質の中で頻繁に疾患を引き起こすサブユニットです (図 5、補足図 6、12、および補足データ 2)。 特に、致死性の常染色体劣性遺伝性先天異常疾患であるメッケル・グルーバー症候群（MKS）を引き起こす変異は、IFT139にのみ見られ（図5および補足データ2）、繊毛機能におけるIFT139の重要な役割を強調しています21,38。 48.

IFT-A の病原性変異は、貨物の配送や IFT 列車の組み立てにおける役割に基づいて、4 つの異なるカテゴリー (タイプ I、II、III、IV) に分類できます。

この研究では、IFT-A複合体の低温EM構造を決定しました。これは、IFT-Aの構造、IFTトレイン内での組み立て、繊毛内でのモーター駆動の貨物輸送におけるIFT-Aの役割を理解するユニークな機会を提供します。 IFT-A タンパク質は、順行性と逆行性の両方のトレイン、さらには細胞質にも存在し、繊毛基部に最も集中して分布しています 5,18,49。 これらの IFT-A コンポーネントが IFT トレインに組み込まれるときに IFT-A 複合体を組み立てるのか、それともトレインに組み込まれる前にまず細胞質内で IFT-A 複合体を事前に組み立てるのかは不明でした。 ここで報告された内因性テトラヒメナ IFT-A 複合体の精製と視覚化は、IFT-A 複合体が繊毛基部であらかじめ組み立てられた双モジュール複合体として存在する可能性が非常に高いことを示唆しています (図 1)。 一貫して、最近の研究では、組換え発現されたヒト IFT-A タンパク質を混合してヒト IFT-A 複合体が得られ、その構造は、原子レベルでは部分的にしか解明されていないものの、テトラヒメナ IFT-A 複合体の細長い立体構造に類似しており、これが裏付けられています。 IFT-A コンポーネントは、IFT トレインに組み込まれる前に溶液中で自発的に IFT-A 複合体を形成する可能性があるという考えです (図 1)29。 この非常に効率的な階層機構は生体高分子集合体に共通の特徴であり、その好例は核孔複合体であり、その形成には明確に定義されたサブ複合体の集合段階の階層が含まれます50。

毛様体基部における順行性 IFT トレインの段階的な組み立て中、最初に自己重合 IFT-B アレイが微小管に付着し、次に IFT-A 複合体が繊毛に面した IFT-B の主鎖上のトレインに組み込まれます。膜（図６）３１． IFT-A と IFT-B の関連付けには IFT74IFT-B と IFT139IFT-A が必要であることが報告されています15,47。 一致して、緑藻クラミドモナスの順行列車のその場密度マップに私たちの高解像度IFT-A構造をモデルフィッティングすると、IFT74IFT-BがIFT139IFT-Aのすぐ近くにあることが明らかになります（図4cおよび補足図11）。 15、27。 事前に組み立てられたIFT-Aは、IFT74IFT-BとIFT139IFT-Aの間の相互作用を通じてIFT-B足場への取り付けを開始し、これによりIFT139IFT-AのN末端TPRのねじれが誘発され、IFT139IFT-Aが相互作用できるようになると提案します。隣接する IFT121IFT-A を使用して、トレイン内のすべての IFT-A ベースモジュールを重合します（図 4a および補足図 11）27。 IFT-A ベース モジュールの IFT139IFT-A ～ IFT74IFT-B 接点に加えて、順行トレインに IFT-A を取り付けると、IFT88IFT-B と IFT144IFT-A の間、および IFT172IFT-B と IFT140IFT-A の間の空間的近接性も明らかになります (図4cおよび補足図11)29、44、45、46。 IFT-AとIFT-Bの間のこれら2つの接触は、IFT122ステムの回転、IFT140とIFT144のTPRアームのねじれの解除など、IFT-Aの順行性トレインへの組み込みを完了するための一連の出来事を伴うものと推測します。これは、アームインアーム方式で隣接する IFT-A 複合体間で IFT140-IFT144 接続を確立することです (図 4b)。 このモデルをさらに検証するには、順行 IFT トレインの高解像度の現場構造情報が必要です。

新たに発現された IFT-A サブユニットの集合および逆行性 IFT トレインの分解から生じる IFT-A 複合体は、基底小体に集中します。 事前に組み立てられたバイモジュラー IFT-A は、ヒンジ領域で曲げたり、柔軟な TPR をねじったりすることで、順行性 IFT トレインに組み込まれます。 先端に到達した後、IFT-A と IFT-B は、おそらくヒンジ領域と柔軟な TPR の調整によって順行トレインから分離され、順行トレインを緩くジグザグな逆行トレインに変換します。 最後に、逆行列車は基底天体に戻り、IFT-A が逆行列車から切り離されてサイクルが終了します。 毛様体先端の回転と逆行列車の組み立てのメカニズム、および IFT-A サイクルにおける折りたたまれた IFT-A 複合体の役割に関する未解決の疑問は、さらなる研究を待っています。

毛様体先端に到達すると、密集した順行性 IFT トレインは、生の断層像で緩やかなジグザグ形状を採用する逆行性トレインに改造されます 15、16、17、18、19、31、51。 同じ IFT-A および IFT-B 複合体は、著しく異なる立体構造を持つこれら 2 つの状態の間でどのように変換されるのでしょうか? IFT-A と IFT-B の両方に共通する顕著な構造的特徴は、中央に柔軟なヒンジ領域を備えたバイモジュラー アーキテクチャです (図 1 および補足図 11)27。 IFT-Aのヘッドモジュールとベースモジュールと同様に、IFT-Bは、それぞれ9.9Åと11.5Åのその場クライオET密度マップで明らかになったように、2つの安定なサブ複合体IFT-B1とIFT-B2で構成されています（補足図） 11)27． これらのモジュールの安定性を考慮すると、順行列車の IFT-A と IFT-B が逆行列車の再組み立て前に個々のサブユニットに完全に分解される可能性は低いです (図 6)。 その代わりに、ダイニン-1bの活性配置の助けを借りて、IFT-AとIFT-BはIFTタンパク質の柔軟なTPRのねじれと組み合わせてヒンジ領域で屈曲し、順行性の列車を次のように変換する可能性が高いと提案します。 IFT-AとIFT-Bの各モジュールの内部構造を維持したまま、ジグザグに逆行する列車を走行させます（図6）。

要約すると、ここおよび他の人によって提示された IFT-A の高解像度原子モデルは、非常に類似した細長い構造を明らかにし、順行性 IFT トレインの組み立てに関する貴重な洞察を提供します 27、28、29、30。 我々の研究のユニークな発見は、伸長および順行性集合構造の両方の IFT-A 構造とは明らかに異なる IFT-A の折り畳まれた状態が同定されたことです。 我々は、この折り畳まれた構造が逆行性トレイン内のIFT-Aに関連する状態であるか、あるいは逆行性IFTトレインが組み立てられる前の毛様体先端の状態を表すと仮説を立てています（図6）。 これらの疑問に答え、順行と逆行の両方の IFT トレインの輸送メカニズムを理解するには、将来の高解像度の現場構造研究が必要です。

テトラヒメナ サーモフィラ株 B2086、CU428.2 およびプラスミド pFZZ-neo4 は、テトラヒメナ ストック センター (コーネル大学) から購入しました。 プラスミド内の FZZ タグは、Flag ペプチド (F) とタンデム プロテイン A ドメイン モジュール (ZZ) の間のタバコ エッチ ウイルス プロテアーゼ (TEV) 切断部位によって分離されました。 IFT122 コード配列の最後の約 1,000 bp と IFT122 3' 非翻訳領域 (UTR) の約 1,000 bp を Tetrahymena ゲノム DNA から個別に増幅し、pFZZ-neo4 ベクターにクローニングしました。 プライマーは次のとおりです。

Fw (IFT122) 5'-CGCTCTAGAACAACCTAATAAAAAAAAAAAAAAGCG-3'、

Rev (IFT122) 5'-ATCGGATCCGAAATCAAAAACATCCTTCTAAGGTCC-3'、

Fw (IFT122 3'UTR) 5'-TCAAGCTTAGCAAAAGCCTACAAATAATTAAAAG-3'、

Rev (IFT122 3'UTR) 5'-CCCCTCGAGACACAAGACTTCGCACATAAAATG-3'。

次に、IFT122-FZZ-neo4を含むDNA断片をベクターからのダブルエンドヌクレアーゼによって消化し、電気的形質転換によってB2086とCU428.2の複合体に注入し、内因性IFT122遺伝子座に組み込みました。 次いで、接合完了体を新鮮なネフ培地に移し、パロモマイシンの濃度を徐々に増加させることによって形質転換体を選択した。 細胞が 24 時間以内に倍加できなかった場合は、単一細胞を BD Influx によって選別し、パロモマイシンを含まない新鮮な培地で 1 週間培養しました。 次に、ゲノム DNA を抽出し、定量的リアルタイム PCR (RT-qPCR) によって細胞の遺伝子型を検証し、大規模培養用に全遺伝子が置換されたクローンを選択しました。

アフィニティー精製のために、FZZ-IFT122 を発現する細胞 20 μL を Neff 培地で 30 °C で対数期中期まで培養しました (1 mL あたり 4 × 105 細胞)。 次に細胞を回収し、50 mM HEPES (pH 7.4)、50 mM NaCl、10% (v/v) グリセロール、0.05% (v/v) IGEPAL CA-630 および 1 × プロテアーゼ阻害剤カクテル (MedChem) を含む緩衝液で溶解しました。急行）。 超音波処理および回転後、上清を収集し、400 μL IgG Sepharose 6 Fast Flow ビーズ (GE Healthcare) とともに 4 °C で 6 時間インキュベートしました。 次に、ビーズを溶解バッファーで洗浄し、TEV プロテアーゼで一晩消化しました。 IgG ビーズからの溶出液を抗 DYKDDDDK G1 アフィニティー樹脂 (GenScript) に 2 時間結合させました。 溶解バッファーで洗浄した後、IFT-A 複合体タンパク質を、50 mM HEPES (pH 7.4)、50 mM NaCl、および 0.025% (v/v) IGEPAL CA を含むバッファー中の 0.2 mg mL-1 Flag ペプチド 2 mL で溶出しました。 -630 で 3 mg mL-1 で 20 μL に濃縮しました。 銀染色 SDS-PAGE ゲル、ネイティブ PAGE ゲル、および質量分析を実行して、IFT-A 複合体の純度および均一性を分析しました。

クライオ EM グリッドは、Vitrobot Mark IV プランジャー (FEI) を 8 °C、湿度 100% に設定して準備しました。 2.5 μL のタンパク質サンプルをグロー放電 Au Quantifoil R1.2/1.3 300 メッシュの穴のあるカーボン グリッド上に適用しました。 その直後に、-1 のブロット力と 3 秒のブロット時間を適用してグリッドをブロットしました。 次に、グリッド上のサンプルを、液体窒素温度で予冷した液体エタン中で急冷することによってガラス化した。

凍結水和グリッドを、Gatan K3 直接電子検出器を備えた 300 kV FEI Titan Krios G3i 電子顕微鏡にロードし、データは EPU ソフトウェア (FEI アイントホーフェン、オランダ) で自動的に取得されました。 ゲイン正規化されたムービーは、超解像モード (ピクセル サイズ 0.55 Å) で倍率 81,000 倍、デフォーカス範囲 -1.5 ～ -2.5 μm で収集されました。 50 e-/Å2 の総線量は 32 フレームに分割されました。 解像度を向上させるために、この作品で提示された構造に対して合計 66,729 個のムービー スタックが取得されました。

グローバルおよびローカルの動き補正と線量重み付けは、MotionCor252 によってオリジナルの超解像度ムービー スタックの各フレームに対して実行されました。 線量加重顕微鏡写真と加重加重なし顕微鏡写真の両方を、ビニング係数 2 で 1.1 Å のピクセル サイズにサイズ変更しました。 線量加重された顕微鏡写真は粒子の選択とさらなるデータ処理に使用され、線量加重されていない顕微鏡写真は Gctf53 でのコントラスト伝達関数 (CTF) パラメーター検索に供されました。 前処理結果の異常値は、モーションと CTF フィッティングの品質をチェックすることによって手動で除外されました。

最初のデータセットでは、約 1000 個の粒子の初期グループが手動で選択され、RELION 3.054 の参照フリー 2D 分類に適用されます。 結果として得られた 2D クラス平均は、Gautomatch (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/download/gautomatch-056/) での自動粒子ピッキングのテンプレートとして使用されました。 すべての粒子は正規化され、抽出中に 128 ピクセルのボックス サイズで 4 つずつビニングされました。 汚染物質やノイズの多い粒子を除去するために、数回の 2D 分類ジョブが実行されました。 次に、出力された粒子に対して、クラス番号と正則化パラメータ T のさまざまな組み合わせを使用した大量の 3D 分類ジョブが実行されました。より高い解像度とより低いノイズ レベルの密度マップに対応するすべての粒子が重複を削除してマージされ、その後、再1.1 Å のピクセル サイズで抽出されました。 マスクされたリファインメント、アライメントなしの 3D 分類、およびローカル角度検索を含む次の高解像度処理ステップにより、ゴールドスタンダード フーリエに基づく 4.8 Å の解像度で IFT-A の基本モジュールであることが判明した密度マップが生成されます。シェル相関 (FSC) カットオフ基準は 0.143。 この新しく取得した密度マップの投影を使用して、すべてのデータセットに対して粒子ピッキングの新しいラウンドが繰り返されました。 新しい粒子セットはピクセル サイズ 4.4 Å に分類され、一連の 2D 分類によってクリーニングされ、最後に 320 Å のより大きな粒子直径で 3D 分類が行われました。 その結果、IFT-Aの基本モジュールと伸長状態および折り畳み状態の完全なIFT-A複合体を含むすべての密度マップが得られました。 粒子のマスク直径の最適化、粒子の再センタリング、およびさらなる 3D 分類により、基本モジュール、折り畳まれた状態の IFT-A および伸長状態の IFT-A のマップの全体的な解像度は、最終的に 3.6 Å、8.8 Å、および 8.8 Å に向上しました。それぞれ8.5Å。 ベイジアン研磨と CTF 改良の後、ヘッド モジュールの密度マップはそれぞれ 4.2 Å (IFT1401-1081 トレーサブル) と 4.6 Å (全長 IFT140 トレーサブル) に改善されました。 ベースモジュールの柔軟な IFT139N (残基 1 ～ 694) とヘッドモジュールの IFT144C (残基 1130 ～ 1387) をより良く視覚化するために、ベースとヘッドの密度マップは最終的に信号によってそれぞれ 4.7 Å と 6.0 Å で分解されました。減算、アライメントなしの分類、およびローカル角度検索。 局所的な解像度の変動は ResMap55 によって推定されます。

私たちは、de-novo モデル構築と剛体ドッキングを組み合わせて、IFT-A 複合体の原子モデルを生成しました。 Coot で IFT-A のモデルを手動で構築するために、コンポーネントの割り当てのために各ドメインの最初と最後にある大きな側鎖を持つ固有の残基に焦点を当てました。 IFT121WD1 の先頭 (残基 1 ～ 10) と末尾 (残基 331 ～ 340) にある芳香族残基により、IFT121 と IFT122 を区別することができました。 同様に、IFT140WD2 の最後の β シート (残基 705 ～ 714) により、IFT140 と IFT144 を区別することができました。 3.6 Å のベース モジュールと 4.2 Å のヘッド モジュールの密度マップの連続性により、ほとんどの IFT-A 残基を明確に追跡することができました。 柔軟性のため、AlphaFold-2 は、ベース モジュールの IFT139N (残基 1 ～ 694)、ヘッド モジュールの IFT144WD1、IFT144C (残基 1130 ～ 1387)、および IFT140C (残基 1082 ～ 1407) のモデル構築を支援するために採用されました 32。 複合体全体の最終モデルは、PHENIX によって繰り返し改良され、MolProbity によって検証されました 56,57。 データ収集と詳細化の統計を表 1 に示します。

私たちは、電子顕微鏡データバンク (EMDB) に保存されている IFT-A の 20.7 Å の in situ クライオ ET マップと伸長状態の IFT-A の構造を使用して、組み立てられた IFT-A ポリマーの擬似原子モデルを構築しました 27 。 ヘッドコアとベースコアの安定性と TPR の柔軟性のため、最初に IFT122 (残基 707 ～ 837)、IFT139 (残基 1 ～ 766)、IFT140 (残基 1035 ～ 1407) および IFT144 を含むフレキシブル TPR を切り捨てました (伸長状態の IFT-A の構造からの残基 966 ～ 1387)。 ヘッド モジュール コアとベース モジュール コアの独特な構造により、高い相互相関スコア (それぞれ 0.80 と 0.77) でそれらを IFT-A のクライオ ET マップに明確に配置することができました。 次に、トポロジーを変更せずに柔軟な TPR を手動で調整して密度に適合させ、組み立てられた IFT-A の構造モデルを構築しました。 最後に、組み立てられた IFT-A モデルの複数のコピーが IFT-A マップにドッキングされました。 IFT-AとIFT-Bの間の相互作用ネットワークを調査するために、IFT-A（20.7Å、EMD-15980）とIFT-B（9.9Å、EMD-15977）をドッキングすることによって、順行IFT列の複合マップが生成されました。 ) を IFT トレインに組み立てます (29.9 Å、EMD-15261)27,31。 微小管（EMD-20631）は先行研究15を参考に配置しました。 次に、組み立てられた IFT-A (この研究)、IFT-B (PDB-8BD7)、およびヒト ダイニン 2 (PDB-6RLA および 6RLB、Chlamydomonas reinhardtii のダイニン 1b) の構造モデルが複合マップに適合されました。前行性 IFT トレインの擬似原子モデルを生成します。 EM 密度マップと原子モデルの図は、UCSF ChimeraX と PyMol58 を使用して生成されました。

伸長状態および折り畳まれた状態については、対応する密度マップを取得するための粒子画像の 2 つのクラスターを使用して、ヘッド モジュールとベース モジュール間の相対配向の分布を計算しました。 以前のコンセンサス改良の結果に従って、粒子の各クラスターが再度中心に配置され、ヘッドとベースの両方で再抽出されました。 10Åにローパスフィルタリングされた伸長状態のマップを参照として使用することにより、再中心化された粒子画像のマスクされた精密化が実行され、ヘッドマップとベースマップがそれぞれ再構築されました。 その結果、各粒子にオイラー角の 2 つのグループが再割り当てされ、ヘッド マップとベース マップに対応する回転行列が取得されました。 頭から根元までの相対回転を示す回転行列は、頭の回転行列と根元の逆回転行列を作成することで算出した。 この行列に基づいて、ZYX シーケンスでオイラー角が取得されました。 以前の研究でも同様の定量化方法が採用されていました59。 順行列車の組み立てられた IFT-A の状態については、ChimeraX を使用して頭部と基部の回転行列を生成し、順行列車モデルの対応する部分を伸長状態の密度マップに適合させました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

IFT-A 複合体のクライオ EM マップは、アクセッション番号 EMD-34893 (伸長状態の IFT-A 8.5 Å)、EMD-34894 (IFT-A 8.8 Åの折り畳み状態) で電子顕微鏡データ バンクに提出されています。 Å)、EMD-34895 (3.6 ÅのIFT-Aのベースモジュール)、EMD-34896 (4.7 ÅのIFT-Aのベースモジュール)、EMD-34897 (4.2 ÅのIFT-Aのヘッドモジュール)、EMD- 34898 (4.6 Å の IFT-A のヘッド モジュール) および EMD-34899 (6.0 Å の IFT-A のヘッド モジュール)、および原子座標はアクセッション コード 8HMC (IFT-A のベース モジュール) でタンパク質データ バンクに寄託されています。 A（3.6 Å）、8HMD（4.7 ÅのIFT-Aのベースモジュール）、8HME（4.2 ÅのIFT-Aのヘッドモジュール）、および8HMF（4.6 ÅのIFT-Aのヘッドモジュール）。 この研究の結果を裏付けるデータセットとプロトコルに関する追加の詳細は、合理的な要求に応じて責任著者によって提供されます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

Nachury, MV & Mick, DU シグナル伝達のための繊毛の組成を確立し、調節する。 ナット。 モル牧師。 セルバイオル。 20、389–405 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reiter, JF & Leroux, MR 繊毛症を支える遺伝子と分子経路。 ナット。 モル牧師。 セルバイオル。 18、533–547 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kozminski, KG、Johnson, KA、Forscher, P. & Rosenbaum, JL 鞭毛の鼓動とは無関係な真核生物の鞭毛の運動性。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 90、5519–5523 (1993)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

石川 H. & マーシャル WF 繊毛形成: 細胞のアンテナの構築。 ナット。 モル牧師。 セルバイオル。 12、222–234 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

コール、DG et al. クラミドモナス キネシン II 依存性鞭毛内輸送 (IFT): IFT 粒子には、線虫の感覚ニューロンにおける毛様体の集合に必要なタンパク質が含まれています。 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 141、993–1008 (1998)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Webb, S.、Mukhopadhyay, AG & Roberts, AJ 鞭毛内輸送列車とモーター: 構造からの洞察。 セミンセル開発バイオル。 107、82–90 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ルッカー、BFら。 鞭毛内輸送複合体 B コアの特性評価: IFT81 サブユニットと IFT74/72 サブユニットの直接相互作用。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 280、27688–27696 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Taschner、M. et al. 鞭毛内輸送タンパク質 172、80、57、54、38、および 20 は、安定したチューブリン結合 IFT-B2 複合体を形成します。 EMBO J. 35、773–790 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Picariello, T. et al. IFT-A 機能の全体的な解析により、膜結合タンパク質の繊毛への輸送に特化していることが明らかになりました。 J. Cell Sci. 132、jcs220749 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scheidel, N. & Blacque, OE 鞭毛内輸送複合体 A 遺伝子は、繊毛の形成と移行帯のゲート制御を異なって制御します。 カー。 バイオル。 28、3279–3287.e2 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mukhopadhyay, S. et al. TULP3 は、IFT-A 複合体と膜ホスホイノシチドを架橋して、G タンパク質共役受容体の一次繊毛への輸送を促進します。 遺伝子開発 24、2180–2193 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, J. et al. キイロショウジョウバエのタビーのホモログである dTULP は、繊毛における一過性受容体電位チャネルの局在を調節します。 PLoS Genet 9、e1003814 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ベハル、RH et al. クラミドモナス・ラインハルティの鞭毛内輸送複合体Aタンパク質のサブユニット相互作用と組織化。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 287、11689–11703 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhu、B.ら。 鞭毛内輸送および繊毛形成における IFT-A 複合体の機能の探索。 PLoS Genet 13、e1006627 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Jordan, MA、Diener, DR、Stepanek, L. & Pigino, G. 鞭毛内輸送列車のクライオ EM 構造は、繊毛の一方向の順行運動を確保するためにダイニンがどのように不活化されるかを明らかにします。 ナット。 セルバイオル。 20、1250–1255 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chien, A. et al. 毛様体先端の IFT 機構のダイナミクス。 Elife 6、e28606 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Mijalkovic, J.、van Krugten, J.、Oswald, F.、Acar, S. & Peterman, EJG C. elegans の毛様体先端における鞭毛内輸送の単一分子ターンアラウンド。 Cell Rep. 25、1701–1707.e2 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Iomini, C.、Babaev-Khaimov, V.、Sassaroli, M. & Piperno, G. クラミドモナス鞭毛のタンパク質粒子は、4 つの段階からなる輸送サイクルを経ます。 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 153、13–24 (2001)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pedersen, LB、Geimer, S. & Rosenbaum, JL クラミドモナスにおける鞭毛内輸送の分子機構を詳しく解説。 カー。 バイオル。 16、450–459 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Buisson, J. et al. 鞭毛内輸送タンパク質は、鞭毛とその基部の間を循環します。 J. Cell Sci. 126、327–338 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

トラン、PV 他 THM1 はマウス音波ヘッジホッグシグナル伝達を負に調節し、繊毛における逆行性鞭毛内輸送に影響を与えます。 ナット。 ジュネ 40、403–410 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iomini, C.、Li, L.、Esparza、JM、Dutcher, SK 逆行性鞭毛内輸送変異体は、Chlamydomonas reinhardtii において複数の遺伝的相互作用を持つ複合体 A タンパク質を同定しました。 遺伝学 183、885–896 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, E.、Sivan-Loukianova, E.、Eberl, DF & Kernan, MJ IFT-A タンパク質は、機械感覚繊毛の機能的に異なるゾーンの境界を定めるのに必要です。 カー。 バイオル。 18、1899–1906 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsao, CC & Gorovsky, MA テトラヒメナ IFT122A は繊毛の組み立てに必須ではありませんが、IFT タンパク質を繊毛先端から細胞体に戻す役割を果たします。 J. Cell Sci. 121、428–436 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ブラック、OE et al. WD リピート含有タンパク質 IFTA-1 は、逆行性鞭毛内輸送に必要です。 モル。 バイオル。 セル 17、5053–5062 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yuan, X. & Yang, S. Cilia/Ift タンパク質と運動関連の骨疾患およびマウス モデル。 フロントバイオシス。 （ランドマーク編）20、515–555（2015）。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lakey, SE、Foster, HE & Pigino, G. 順行性鞭毛内輸送列における IFT-A および IFT-B の分子構造。 Nat Struct Mol Biol (2023)。

Meleppattu, S.、Zhou, H.、Dai, J.、Gui, M. & Brown, A. 繊毛輸送のための列車への IFT-A 重合のメカニズム。 セル 185、4986–4998.e12 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hesketh, SJ、Mukhopadhyay, AG、nakamura, D.、Toropova, K. & Roberts, AJ IFT-A 構造は、繊毛への膜タンパク質輸送のためのキャリッジを明らかにします。 セル 185、4971–4985.e16 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jiang、M.ら。 ヒト IFT-A 複合構造は、繊毛輸送に関する分子的洞察を提供します。 セル解像度 （2023年）。

van den Hoek、H. 他毛様体基部のその場での構造は、鞭毛内輸送列車の段階的な組み立てを明らかにします。 サイエンス 377、543–548 (2022)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

ジャンパー、J. et al. AlphaFold による高精度なタンパク質構造予測。 Nature 596, 583–589 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ムーサ、S.ら。 アルゼンチンの頭蓋外胚葉異形成患者3名における新規IFT122変異：変異スペクトルの拡大。 午前。 J. Med Genet A 170A、1295–1301 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Bredrup, C. et al. IFT-A 遺伝子 WDR19 の変異による骨格異常および腎不全を伴う繊毛症。 午前。 J. ハム。 ジュネ 89、634–643 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サン、Ｙら。 メンデル病の包括的な検査としてターゲットを絞った次世代シーケンス: コホート診断研究。 科学。 議員第 8 号、11646 (2018)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu、M.ら。 ヒト IFT140 の変異は、非症候性網膜変性を引き起こします。 ハム。 ジュネ 134、1069–1078 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Silveira, KC、Moreno, CA & Cavalcanti, DP ビーマー・ランガー症候群は、IFT122 の両対立遺伝子変異による繊毛症です。 午前。 J. Med Genet A 173、1186–1189 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

平野、T.、加藤、Y. & 中山、K. 鞭毛内輸送-A 複合体は、繊毛への侵入と繊毛 G タンパク質共役受容体の逆行性輸送を媒介します。 モル。 バイオル。 セル 28、429–439 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、W.ら。 骨格性繊毛症における遺伝子構造と表現型のスペクトルを拡大します。 ハム。 ムタット。 39、152–166 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Stranneheim, H. et al. 全ゲノム解読の医療現場への統合: 3,219 人の希少疾患患者における複数の臨床機関にわたる高い診断率。 Genome Med 13, 40 (2021)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Gotthardt、K.ら。 Arl13B から Arl3 への G タンパク質活性化カスケードと脂質化タンパク質の繊毛標的への影響。 Elife 4、e11859 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ジャコビー、M.ら。 INPP5E 変異は、ヒトおよびマウスにおいて原発性繊毛シグナル伝達欠陥、繊毛不安定性および繊毛症を引き起こします。 ナット。 ジュネ 41、1027–1031 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Fu、W.、Wang、L.、Kim、S.、Li、J.、Dynlacht、BD 一次繊毛への選択的輸送における IFT-A 複合体の役割。 Cell Rep. 17、1505–1517 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

小林 哲也、石田 裕也、平野 哲也、加藤 裕也、中山 和也。IFT-A 複合体と IFT-B 複合体の協力は、毛様体の逆行性タンパク質輸送と GPCR の輸入に必要です。 モル。 バイオル。 セル 32、45–56 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

石田泰、小林哲、千葉伸、加藤裕、中山和。頭蓋外胚葉異形成で見出される複合ヘテロ接合型IFT144/WDR19変異によって引き起こされる毛様体欠損の分子基盤。 ハム。 モル。 ジュネ 30、213–225 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Follit、JA、Xu、F.、Keady、BT、Pazour、GJ マウス IFT 複合体の特性評価 B. Cell Motil。 細胞骨格 66、457–468 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brown, JM、Cochran, DA、Craige, B.、Kubo, T. & Witman, GB 毛様体基部での IFT 列車の組み立ては IFT74 に依存します。 カー。 バイオル。 25、1583–1593 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davis、EEら。 TTC21B は、繊毛症スペクトル全体にわたって、原因となる対立遺伝子と修飾する対立遺伝子の両方に寄与します。 ナット。 ジュネ 43、189–196 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィングフィールド、JL 他 IFT は、繊毛への連続放出のために、毛様体基部の集合キューのさまざまな段階でトレーニングします。 Elife 6、e26609 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

オニシェンコ、E. et al. 代謝標識によって明らかにされる多タンパク質複合体の成熟動態。 セル 183、1785 ～ 1800 年 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Stepanek, L. & Pigino, G. 微小管ダブレットは、鞭毛内輸送列車用の複線鉄道です。 サイエンス 352、721–724 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Zheng、SQら。 MotionCor2: 改善されたクライオ電子顕微鏡のためのビーム誘起運動の異方性補正。 ナット。 方法 14、331–332 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, K. Gctf: リアルタイム CTF の決定と修正。 Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． バイオル。 193、1–12 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジバノフ、J.ら。 RELION-3 での自動高解像度クライオ EM 構造決定のための新しいツール。 Elife 7、e42166 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Swint-Kruse, L. & Brown, CS Resmap: 高分子界面の二次元ネットワークとしての自動表現。 バイオインフォマティクス 21、3327–3328 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

チェン、VBら。 MolProbity: 高分子結晶学の全原子構造検証。 アクタクリスタログル。 Ｄ．Ｂｉｏｌ． クリスタロガー。 66、12–21 (2009)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

アフォニン、PV 他。 phenix による結晶構造の自動化の精密化に向けて。 リファイン。 アクタクリスタログル。 Ｄ．Ｂｉｏｌ． クリスタロガー。 68、352–367 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ペッターセン、EF 他。 UCSF ChimeraX: 研究者、教育者、開発者向けの構造視覚化。 タンパク質科学。 30、70–82 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウェブスター、MW et al. 細菌における転写と翻訳の共役と衝突の構造基盤。 サイエンス 369、1355–1359 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

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データ収集中に技術サポートと援助を提供してくれた上海精密医学研究所の電子顕微鏡施設と質量分析施設のスタッフに感謝します。 IFT-A 疾患について情報を提供していただいた上海交通大学医学部、上海小児病院の Wenyan Huang 氏に感謝します。 この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (YM への 2016YFA0501800、ML への 2018YFA0107004 および 2018YFC2000102)、中国国立自然科学財団 (ML への 31930063、JW への 32071189、CH への 31971137)、の革新的研究チームによって支援されました。上海のハイレベル地方大学 (SHSMU-ZLCX20211700 から ML、JW、YM) および上海市教育委員会高峰臨床医学補助金支援 (20181711 から JW)。

これらの著者は同様に貢献しました: Yuanyuan Ma、Jun He。

第九人民病院、上海交通大学医学部、上海、200011、中国

ユアンユアン・マー、ジュン・ヘ、シャオバイ・リー、チェンフイ・ファン、ジャン・ウー、ミン・レイ

上海精密医学研究所、上海、200125、中国

ユアンユアン・マー、ジュン・ヘ、シャオバイ・リー、チェンフイ・ファン、ジャン・ウー、ミン・レイ

上海交通大学医学部仁吉病院、上海、200032、中国

ヤオ徳強

がん遺伝子および関連遺伝子の国家重点研究所、上海交通大学医学部、上海、200025、中国

ミン・レイ

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ML と JW がこのプロジェクトを発案しました。 YM は IFT-A 複合体を精製し、クライオ EM 標本を調製し、データセットを収集しました。 YM と SL が構造を決定しました。 JH、DY、JW はモデルの構築と改良を実施しました。 すべての著者がデータ解釈に貢献しました。 JW は、IFT-A の折り畳まれた状態の特定に大きく貢献しました。 そしてMLYMCHとJHが原稿を書きました。

Jian Wu または Ming Lei との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Saikat Mukhopadhyay と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Ma、Y.、He、J.、Li、S. 他鞭毛内輸送複合体 IFT-A と前行性 IFT トレインにおけるその集合体に関する構造的洞察。 Nat Commun 14、1506 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37208-2

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受信日: 2022 年 12 月 9 日

受理日: 2023 年 3 月 6 日

公開日: 2023 年 3 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37208-2

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ネイチャーの構造および分子生物学 (2023)

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