ウシ血清アルブミン

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12336 (2022) この記事を引用

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7 オルトメトリック

メトリクスの詳細

グラフェンとそのファミリーは、その超機械的特性、導電性、抗菌特性により、組織工学において大きな可能性を秘めています。高表面積や、酸化グラフェンファミリーの高酸素含有基によるすぐに使用できる機能化などのグラフェンの他の特性を考慮すると、骨組織工学でいくつかのニーズに対処できる可能性があります。ここでは、グリーンで新しい方法を使用して、酸化グラフェンの還元プロセス中にストロンチウムナノ粒子（SrNP）を合成および修飾しました。ヒドラジンや化学リンカーを使用せずに、BSA を使用してストロンチウム NP を合成し、同時に rGO の表面に修飾しました。 UV-Vis、FTIR、およびラマン分光法の結果は、BSA が rGO 表面の酸化グラフェンと修飾 SrNP を首尾よく還元できることを実証しました。 FESEM と TEM は、その場で合成された SrNP の直径が 25 ～ 30 nm であることを示しました。興味深いことに、SrNPs-rGOで処理したMC3T3-E1細胞の細胞生存率は、一定濃度のBSA-rGOおよびGOよりも有意に高かった。さらに、これらのナノシートのアルカリホスファターゼ活性 (ALP) を調べたところ、Sr-BSA-rGO が GO および BSA-rGO よりも ALP 活性を増強することが示されました。注目すべきことに、MC3T3-E1 細胞の RUNX 2 および Col1 遺伝子の相対的発現は、Sr-BSA-rGO ナノシートで処理するとブーストされました。この研究は、ナノシートの表面にスマートナノ粒子を装飾するための環境に優しく簡単な薬剤としてタンパク質や他の生体分子を使用することが有望であり、研究者が過酷で有毒なヒドラジンのような材料を生体に優しい方法で置き換えるのに役立つことを明らかにしました。これらの結果は、Sr-BSA-rGO が骨組織を再生する優れた能力を有しており、インプラントにおける骨形成ブースターとして使用できることを実証しました。

骨は、機械的支持、臓器の保護、骨格の連続性の基盤として機能するため、体内で最も重要な組織の 1 つです。骨構造の完全性への損傷は、外傷、手術、腫瘍、骨粗鬆症など、さまざまな原因で発生する可能性があります1。ほとんどの場合、骨はそれ自体を再生および修復する大きな能力を持っています。ただし、骨組織の完全な再生が不可能で、さらなる刺激が必要な特定の状況もあります2。生体材料は、骨組織工学における骨移植に代わる実行可能な代替手段です 3,4。合成ヒドロキシルアパタイト、リン酸三カルシウム、その他のバイオセラミックス、ポリマー足場および金属インプラントは、骨および硬組織工学で広く利用されている生体材料の例です4。ナノテクノロジーの進歩は、臨床科学におけるナノ医療研究を変革し、その結果、機能性ナノ材料の設計と完全な統合に依存する新しいナノデバイスとナノシステムが誕生しました。グラフェンファミリー誘導体は、多くの合成ナノ生体材料の中でも生物医学応用で大きな関心を集めています5,6。酸化グラフェン (GO) として知られる、ハイブリッド化した sp2 炭素原子を備えたグラフェンシートの親水性バージョンは、有望な生物医学用途として浮上しています 7。毒性、生体適合性、反応部位が最小限に抑えられた酸化グラフェンの還元型は、細胞活動を刺激し、骨組織の骨形成能力を高めるために利用される可能性があります8、9、10。これに関連して、ストロンチウム (Sr) の整形外科的治療特性が関心を集めています 11。人間の硬組織には Sr が蓄積する可能性があり、これにより骨ミネラルのアパタイト相からカルシウムが置換される可能性があります。 Sr は骨の圧縮強度の増加にも関連しますが、その不足は硬組織に悪影響を及ぼします。 in vitro および in vivo 研究では、Sr イオンが骨形成を刺激し、骨吸収を阻害するため、骨粗鬆症の治療薬となる可能性があることが実証されています 12。 Sr の特性により、その利点により生体活性ガラスやバイオセラミックスの成分として人気があります 13。 Sr は、カルシウムイオン (Ca2+) と構造的および物理化学的に類似しているため、骨のリモデリング用途に使用されてきました。たとえば、リン酸カルシウムやチタンのインプラントへの Sr の組み込みは、これらの材料の骨形成特性を強化するために研究されています 14。グラフェンナノシートの表面積は大きいため、最近、研究者らは GO と Sr15 の共還元によってグラフェンの表面に SrNP を合成しました。還元剤としてのヒドラジンは、Kumar et al.16 によって報告された rGO 表面の SrNP を還元するために使用されました。最近、Qi ら。 3D 足場の作製のために、ポリ (L-ラクチド) (PLLA) に組み込まれたヒドラジンを使用して、Sr 修飾 rGO ナノシートを合成しました。 Sr-rGO における骨形成誘導は、rGO および純粋な PLLA 足場よりも優れていました 15。しかし、合成プロセスでヒドラジンを使用してグラフェンの強度とSr骨形成特性を高めることには大きな懸念があったため、これらの研究は骨組織工学に対するSr-rGOナノシートの高い能力を実証しました。まず、rGO ナノシートの水溶性が大幅に低下し、グラフェンベースの複合材料の製造プロセスが困難になっています。第二に、ヒドラジンは実験中にユーザーの健康に影響を与える有毒試薬でした17。ヒドラジンのこの限界を克服するために、環境に優しく安全な還元剤を導入するために多くの努力がなされてきました。たとえば、ウシ血清アルブミン (BSA) やアスコルビン酸などのタンパク質は、GO3、18、19 の安全な還元剤です。

タンパク質は疎水性セグメントと親水性セグメントを備えた複雑な生体高分子であり、固体表面への接着剤として機能する可能性があります20。 BSA は 583 個のアミノ酸残基を持つ球形のタンパク質です21。 BSA の構造には、BSA を別個の還元剤として区別するチロシン残基があります 20。 BSA の疎水性部分は疎水性表面積に吸着される可能性がありますが、BSA の親水性部分は酸素の存在下で水官能基と相互作用する可能性があります 22。

この研究では、グラフェンで修飾された Sr ナノシートが、BSA の存在下で GO と硝酸ストロンチウムの共還元によって合成され、Sr-BSA-rGO と名付けられました。合成プロセスを図1に示します。Sr-BSA-rGOでは、SrNPはrGOナノシートの表面に位置しており、還元後のrGOナノシートの再積層をブロックする立体障害として機能するBSAと密接に連携しています。次に、rGO の表面上の SrNP の存在を、さまざまな方法を使用して研究しました。以下では、増殖に対するBSA-rGO修飾Srの効果を調べるために骨芽細胞株を利用した。骨組織工学における重要な要素であるアルカリホスファターゼ（ALP）活性も調べました。最後に、リアルタイム PCR を使用して COL1 および RUNX2 遺伝子の発現を明らかにしました。

骨組織工学における Sr-BSA-rGO ナノシート。この図は、この研究で使用された化学研究室から分子遺伝学研究室への合成および応用プロセスを示しています。

グラファイト、KMnO4、硫酸 (H2SO4) は Merck から購入しました。 BSA、硝酸ストロンチウム (SrNO3) は Sigma から購入しました。すべての試薬は精製せずに使用しました。

改良されたハマー技術に沿って、実験室環境で黒色黒鉛を化学酸化することによって酸化グラフェン粉末が製造されました。この方法では、1 g のグラファイトを氷浴中で 23.3 ml の H2SO4 にさらし、そのグラファイトを酸性媒体の間に挿入しました。酸化剤が酸の挿入を置き換えて、元の状態のグラファイト酸化物を生成しました。純粋な酸化グラファイト (PGO) を生成するために、KMnO4 を酸化剤として使用し、5 ℃から 15 ℃まで徐々に添加しました23。黒鉛を酸化黒鉛（GO）に変換するために不純物の精製を行った。 PGO 加水分解を使用して、残留する硫酸塩汚染物質を除去しました。ＰＧＯの共有結合硫酸塩を除去するために、１５０ｍｌの蒸留水を添加し、撹拌条件下で３０分以内に温度を９０℃に上昇させ、系を５００ｍｌの蒸留水で再度希釈した。たとえば、過酸化水素 (H2O2) を瞬時に滴下して、色が暗褐色に変化した未反応の KMnO4 を差し引きます 24。酸化グラファイト溶液を濾過し、８０００ｒｐｍの遠心分離機中で希ＨＣｌおよびエタノールで洗浄し、室温で乾燥させた。超音波処理を行ってGOナノシートを剥離した。酸化グラファイト粉末を脱イオン水（10 mg/ml）に分散させ、その後出力 30 w で 3 時間超音波処理しました（氷浴を使用して溶液の温度を 4 °C にする必要があることに注意してください）。

Sr を GO 表面に結合するために、緑色還元剤およびバイオ接着剤として BSA を使用しました。最初に、超音波を使用して 0.5 g の GO を脱イオン水 (200 ml) に分散させ、水中で GO 層を剥離しました。２．５ｇのＢＳＡを、撹拌条件下で剥離したＧＯ溶液に添加した。 BSAとGOを反応させるために、1M NaOHを滴下して溶液のpHを11.5に上昇させた。 GO-BSA 混合物を 24 時間混合し、可溶性不純物をエタノール遠心分離によって分離しました。 Sr-BSA-rGO の生成では、硝酸ストロンチウムをさまざまな濃度 (GO の 5、10、20 wt%) で GO と組み合わせました。簡単に説明すると、BSA-rGO を分散させ、脱イオン水中で 1 時間超音波処理しました (出力: 30 W)。次に、硝酸ストロンチウムをrGO溶液に添加し、2時間撹拌して均一な混合物を得た。次いで、混合物をエタノールで洗浄した。

この研究では、PHILIPS-PW1730 回折計を使用し、Cu-K 放射線を使用して生成された粉末の X 線回折分析を使用して、相と結晶化度を決定しました。生成されたナノシートの微細構造特性は、電界放射型走査電子顕微鏡 (FESEM、日立 S-3400 N、電圧 20 kV) および遷移電子顕微鏡 (TEM、フィリップス、CM300) を使用して調査されました。ラマン分光法は、TakRam N1-541 (Teksan Co, Iran) を使用して実施されました。 FTIR スペクトルは、TENSOR 27 Brucker を使用して記録されました。

我々は、イランパスツール研究所（IPI）のイラン国立細胞バンク（NCBI）から採取したMC3T3-E1細胞株を利用しました。細胞は、10% (v/v) 熱不活化 (50 °C、30 分) ウシ胎児血清 (FBS、 10% v/v)、2 mM L-グルタミン、100 単位/mL のペニシリン、および 100 mg/mL のストレプトマイシン、37 °C、5% CO2、加湿インキュベーター内。次に、細胞が 70 ～ 80% コンフルエントになるまで増殖した後、細胞をトリプシン処理 (0.025% トリプシン、0.02% EDTA) しました。処理前に、細胞を一晩放置して、96 ウェル細胞培養プレートの底に再付着させました。

MC3T3-E1 細胞の生存率に対する Sr-BSA-rGO、BSA-rGO (グラフでは rGO と命名)、および GO 処理の効果は、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5 を使用して測定されました。所望の各治療時間における臭化ジフェニルテトラゾリウム（MTT）アッセイ。 Sr-BSA-rGO ナノシートの作業溶液 (1、10、50、および 100 μg/ml) を、1 mg/ml ストック溶液 (DMEM 培地に分散) を含む DMEM 培地で調製しました。また、GO および BSA-rGO ナノシート溶液 (濃度 100 μg/ml) を使用して、Sr ナノ粒子の効果を研究しました。処理後、細胞生存率に対する異なるインキュベーション時間の影響を研究するために、プレートを 24、72、および 120 時間インキュベートしました。各時点で、20μlのMTT溶液(5mg/ml)を細胞培養の各ウェルに添加した(培地容量:200μl)。プレートを 37 °C で 4 時間インキュベートしました。インキュベーション後、前の溶液をゆっくり除去し、続いて100μlのDMSO溶液を各ウェルに加えた。細胞培養プレートをインキュベーターに戻して 1 時間放置しました。 BioTek プレートリーダーを使用して 570 nm で吸光度を測定しました。

ALP は、骨組織工学において測定すべき最も重要な要素の 1 つです。異なるインキュベーション時間で Sr-BSA-rGO、BSA-rGO、GO ナノシートで処理した細胞の生存率を測定した後、最高濃度の Sr-BSA-rGO (100 μg/ml) と一定濃度の BSA-rGO およびMC3T3-E1 細胞の ALP 活性を研究するための GO ナノシート (100 μg/ml)。細胞を 6 ウェルプレート上で培養し (ウェルあたり 100 × 103 細胞)、一晩インキュベートしてプレートの表面に接着させました。以下では、培地をナノシートの作業溶液に置き換え、インキュベーター内で回収しました。 ALPキット（イラン、パルス・アズムン）を製造プロトコールに従って実験に利用した。 405 nm プレートリーダーを使用してウェルの吸光度を記録しました。

Sr-BSA-rGO 処理サンプル上で培養した細胞の骨形成分化能を調べるために、骨形成関連遺伝子の発現を検査しました。簡単に説明すると、細胞を 6 ウェルプレートのウェルあたり 104 細胞の密度で収集し、一晩培養しました。その後、Sr-BSA-rGO ナノシートを培地 (100 μg/ml) に混合し、1、3、5 日間培養し、ウェルを対照 (ナノシートなし) とみなしました。次いで、細胞をＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、０．２５パーセントのトリプシンで消化した。細胞 RNA を RNX 試薬 (Zist Idea) で抽出し、PrimeScript 1st stranc DNA 合成キット (イラン) で cDNA に逆転写しました。最後に、Col1 および runt 関連転写因子 2 (Runx2) のレベルを測定しました。各グループを 3 回検査しました。この研究で使用したプライマー設計の詳細を表 1 に示します。

すべてのデータは 3 回収集され、Graphpad prism 8 ソフトウェアを使用してグラフが作成されました。二元配置分散分析を使用して、グループ間の差異の重要性を研究しました。

図 2a は、GO、BSA-rGO、BSA の UV-Vis スペクトルを示しています。グラフェンファミリーのパッションフォームである GO は、独特の UV-Vis スペクトルを示しました。これらのスペクトルでは、GO の特徴的なピークはそれぞれ π-π 相互作用と n-π 相互作用に起因する 225 nm と 310 nm でした。このピークの出現により、生成したグラフェンの剥離・酸化過程が確認された。 BSA で GO を還元した後、232 nm のピークは 260 nm にシフトし、310 nm のピークの強度は大幅に減少しました。 BSA 分子を GO に投与すると、還元プロセスによりこれらのピークがシフトまたは消失しました。 GOの茶色がかった色は還元後に黒色に変化し、BSA-rGO混合物にSrを添加すると黒色が安定することがわかりました（図2b、画像は合成の1週間後に記録されました）。 GO、BSA-rGO、Sr-BSA-rGOのXRDパターンを図2cに示します。 GO に対応するパターンは、(001) 間隔に起因する 2θ = 12.3° に特徴的なピークを示します。生成された酸化グラフェンのシェラー方程式とd-spacingによれば、積層高さは8.9nm、層数は8である。 BSA のアミド結合により、BSA-rGO では 20 ～ 27°の範囲に位置する幅広でかなり強いピークが検出されました。一方、BSA 内で GO が均一に分散しているため、BSA-rGO 複合材料の XRD パターンには特徴的な GO ピークがなく、BSA-rGO 内の GO の長距離無秩序または完全な剥離を意味し、結果は一貫しています。先行研究あり25。最終的な XRD パターンでは、金属ストロンチウムと rGO ナノシートの特徴的なピークが観察できました。 25.42°および29.46°のピークは、ストロンチウムの立方最密構造（JCPDS 89-4045）の[111]および[200]結晶面に対応していましたが、BSA-rGOの弱くて幅広いピークが検出できました。 20〜27°で。 rGO ピーク強度の減少は、その表面に付着した金属 SrNP が BSA-rGO ナノシートの再積層を妨げ、その結果、BSA-rGO ナノシートよりも良好に剥離された Sr-BSA-rGO ナノシートが得られたことを示しています。

Sr-BSA-rGO ナノシートの特性評価。 (a) 脱イオン水に分散した BSA、GO、BSA-rGO の UV-Vis スペクトル (濃度: 0.1 mg/ml)。 (b) 合成された GO、BSA-rGO、および Sr-BSA-rGO の画像。 (c) および (d) それぞれ、GO、BSA-rGO、および Sr-BSA-rGO ナノシートの XRD および FTIR プロファイル。

GO または rGO 上で金属 NP を成長させると、金属粒子が再積層を妨げるため、積層された黒鉛ピークが消失または減少することが実証されています。十分に剥離されたｒＧＯ表面上の結晶性金属ＳｒＮＰの存在は、ＧＯの合成およびＧＯからｒＧＯへの血清還元を示すＸＲＤデータによって検証された。合成されたGO、BSA-rGO、およびSr-BSA-rGOのFTIRスペクトルを図2dに示します。 FTIR スペクトルの特徴的な GO ピークは、それぞれ O-H、C=O、および C=C 結合を持つ 3386 cm-1、1728 cm-1、および 1615 cm-1 に対応します26。また、1050 cm-1 と 1224 cm-1 のピークは C-O 伸縮振動に関係し、また 1376 cm-1 の特徴ピークは C-O27 の変形振動に属します。 GO と比較して、BSA-rGO パターンにはいくつかの変更があります。 O=C-NH の混合振動に特有の 630 cm-1 のピークは、GO 化合物上に堆積した BSA の結合に関連していました。 2850 cm-1 に現れた新しいピークは、BSA メチレン官能基の C-H 伸縮振動のものでした 25。要約すると、GO および BSA-rGO ナノシートの場合、GO ナノ粒子とは異なり、BSA 含有化合物における 630 cm-1 および 2850 cm-1 のピークの出現により、BSA-rGO 複合体の形成が確認されました。 630 cm-1 および 2850 cm-1 での Sr-BSA-rGO の減少が証明され、正に帯電した SrNP が rGO ナノシートの表面で強く装飾されていました。一方、硝酸ストロンチウムを導入すると水酸基が減少することが観察されました。以前の報告によると、ヒドロキシル基は電気陰性度により Sr2+ イオンと相互作用する可能性があり、Sr 修飾後は FTIR スペクトルにおけるヒドロキシル基の強度が減少すると考えられます 28。

ラマン分光法は、グラフェンベースの材料の結晶構造に関する貴重な情報を提供するため、カーボンベースのナノシートを特性評価するのに役立つ技術です。グラファイトの酸化によるさまざまな酸素基により、GO の極めて不規則な構造が確立されます。図3aは、GO、BSA-rGO、およびSr-BSA-rGOナノシートのラマンスペクトルを示しています。すべてのパターンは、D バンドと G バンドに対応する 2 つの主要なピークを示しました。 D バンドは不完全で無秩序な炭素サイトの存在を明らかにしましたが、G バンドは組織化された炭素原子に関連付けられていました 29。 D バンドと G バンド (ID/IG) は、秩序のある黒鉛構造と無秩序な黒鉛構造を決定するための重要なパラメーターでした 27。相対強度比 (ID/IG) の増加または減少により、構造の変化がわかります。 BSA-rGOのラマンスペクトルは、それぞれDバンドとGバンドに関連する1347cm-1と1599cm-1に2つのピークを示しました。 BSA-rGO の G バンドは、炭素原子の六方晶系ネットワークによる欠陥の修復に対応します 30。相対的な ID/IG 比は 1.108 で、GO 構造の縮小プロセスが確認され、大量の構造欠陥が生じています 30。ストロンチウムの吸着後、D バンドは 1347 cm-1 に留まり、G バンドは 1594 cm-1 に移動しました。 G バンド強度のわずかな増加により (ID/IG: 0.976) 比が減少し、BSA-rGO ハイブリッドとストロンチウム間の強い相互作用が示されました。金属 SrNP は BSA-rGO の無秩序な構造を改善し、BSA-rGO27 の欠損部位におけるストロンチウムの架橋との強い相互作用があることが確認されました。サンプルは、スライドガラス上にドロップキャストすることによって AFM イメージング用に準備され、溶媒は室温で一晩蒸発させました。図 3b ～ g は、さまざまな AFM 画像と高さプロファイルの測定結果を示しています。 AFM 画像の高さプロファイルによると、BSA-rGO の厚さは GO の厚さを上回っており、BSA が疎水性相互作用と π-π スタッキング相互作用を介して安定剤として rGO に吸着している可能性があることが示唆されます。別の発見は、Sr-BSA-rGO ナノ複合材料の典型的な平均厚さは、表面上の SrNP の存在に起因する RGO の典型的な平均厚さよりも重要であるということでした。コーティング後のグラフェンナノシートの厚さの増加は、以前に報告されています。たとえば、Upadhyay et al. らは、ポリエチレンが GO31 の表面にグラフトされたときに、GO ナノシートの厚さ 1 ～ 110 nm の増加が検出されたと報告しました。別の研究では、GO ナノシートをポリドーパミンで還元および修飾すると、GO ナノシートの厚さが増加しました 32。以前、私たちはグラフェンシートのその場合成と標識にハーセプチンというモノクローナル抗体も利用し、抗体の導入によりグラフェンの厚さが増加することを発見しました33。

ナノシートの構造と形態。 (a) GO、BSA-rGO、Sr-BSA-rGO ナノシートのラマンスペクトル。（ b – d ）それぞれ GO、BSA-rGO、Sr-BSA-rGO ナノシートの AFM 画像。（e – g）それぞれGO、BSA-rGO、Sr-BSA-rGOの厚さプロファイル。

我々の調査結果によれば、GOのゼータ電位値は-28.5 mVです（図4）。これは主に、GO 表面の酸素官能基と残留負電荷密度によるものです。ただし、BSA-rGO 電圧は -29.47 mV に減少し、GO と比較してより負になります。これは、BSA の親水性セグメントにより、BSA-rGO が GO よりも安定した水分散液を持っていることを示しています。 SrNP は水への溶解度が低いため、ゼータ電位値が -6 mV でしたが、Sr-BSA-rGO はゼータ電位値が -22.03 mV でした。 BSA-rGO と Sr-BSA-rGO の違いは、BSA-rGO 上に金属ストロンチウムがよく付着していることを示しています。この結合にもかかわらず、Sr-BSA-rGO ナノシートは負の値を示し、水生環境における安定性を示しました。

GO、BSA、Sr、BSA-rGO (RGO として図示)、および Sr-BSA-rGO (RGO-Sr として図示) のゼータ電位。

BSA-rGOナノシート表面上のSrNPの集合を確認するために、FESEMを使用しました。図5に示すように、SrNPは分散およびクラスター化された形でBSA-rGOナノシートの表面に堆積しました。また、ナノシートの表面上のSrNPをよりよく示すために、FESEMの後方散乱電子オプションも使用しました（図5b）。 SrNPはグラフェンナノシートよりも軽いことが観察されています。図５ｃによれば、ＳｒＮＰのサイズは２０ｎｍ付近で観察され、ＳｒＮＰは球形を有していた。 Sr-BSA-rGOのEDSスペクトルは、10.57％の重量パーセントのストロンチウムの出現が、BSA-rGOの大きな表面積上のSrNPの効果的な装飾の明らかな証拠であることを示しました（図5d）。 BSA-rGO の表面上の SrNP の分散は、元素マッピング分析によって監視されました。ハイブリッドナノコンポジットは主成分としてC、O、N、Srを含み、各元素は均一に分散しており(図6)、FESEM像と一致した。

Sr-BSA-rGO ナノシートの FESEM 画像。 (a) および (c) 二次電子像。 (b) 反射電子像 (黄色の矢印は Sr NP を示します)。 (d) Sr-BSA-rGO ナノシートの EDS 分析。

（a – e）Sr-BSA-rGOのC、N、O、Sr元素の元素マッピング画像。 (f) 炭素とストロンチウムの合成画像。 (g) FESEM における炭素とストロンチウムの結合画像。

透過型電子顕微鏡 (TEM) は、集合した NP の粒径、サイズ分布、形状を測定するための効率的な手法です。図 7a、b は、GO および BSA-rGO ナノシートの TEM 画像を示しています16。 BSAによる還元後のGOナノシートには凝集の兆候はなく、図にはすでに剥離された粗いナノシートが示されており、折り畳まれた広い表面積と凝集した構造が明らかになりました。これらの画像は我々の XRD を裏付け、BSA の存在下では GO ナノシートの凝集がないことが確認されました。図7c、dは、BSA-rGOナノシートの表面によく分散したストロンチウムクラスターと単分散NPを示しました。図7c、dの黒い点は、親水性のしわのあるrGOナノシートの表面に同様に分散した結晶性金属ストロンチウムNPを示しています。

(a) GO、(b) BSA-rGO、および (c、d) Sr-BSA-rGO ナノシートの TEM 画像。 TEM 画像の黒い点は Sr ナノ粒子でした。

MTT アッセイを使用して、GO、BSA-rGO、および Sr-BSA-rGO ナノシートの細胞毒性を研究しました。図8aに示すように、GOナノシートは、一定濃度（100μg/ml）で24、72、および120時間インキュベートした後、対照と比較して、MC3T3-E1細胞の生存率をそれぞれ70、55、および47％に減少させた。 BSA-rGO との 24、72、および 120 時間のインキュベーションにおける細胞生存率は、それぞれ 80、70、および 75% でした。 BSA-rGO ナノシートは、同じ濃度の GO と比較して細胞の生存率を増加させました。細胞生存率に対する Sr-BSA-rGO ナノシートの効果をよりよく研究するために、さまざまな濃度の Sr-BSA-rGO ナノシート (1、10、50、100 μg/ml) を利用しました。異なる濃度の Sr-BSA-rGO ナノシートとインキュベートした細胞の細胞生存率は 80% を超えました。これらのナノシートは、GO および BSA-rGO と比較して最も高い細胞生存率を示しました。 GO の毒性は、高濃度では無視できる程度の毒性しかないことが広く調査されています。さらに、タンパク質でコーティングされたナノシートと基板には、細胞の増殖と生存率を改善する大きな可能性があります。たとえば、Ahadian et al. BSA とグラファイトを使用したグラフェンナノシートの水溶液が、細胞の生存率と増殖率を高めることができたと報告しました 22。さらに、異なる濃度の Sr-BSA-rGO ナノシートで処理したグループでは細胞生存率が向上していることがわかりました。 SrNP とグラフェンナノシートの非共有結合性相互作用により、SrNP は培地中に放出される可能性があります。 Sr イオンは、特に骨組織工学において細胞の生存率を高める能力を持っていました 15。

合成されたナノシートの生物学的評価。 (a) さまざまな濃度の Sr-BSA-rGO (1、10、50、100 μg/ml) および一定濃度の GO および BSA-rGO (100 μg/ml) で処理した MC3T3-E1 細胞の細胞生存率測定 (MTT アッセイ) μg/ml)を様々なインキュベーション時間(24、72、および120時間)で測定した。（ b ）異なるインキュベーション時間（24、72および120時間）で一定濃度のGO、BSA-rGOおよびSr-BSA-rGOナノシート（100μg/ml）で処理したMC3T3-E1細胞のALP活性測定。すべての実験は 3 回繰り返して行われました (n = 3)。 (c) MC3T3-E1 細胞の骨形成分化に対する Sr-BSA-rGO の効果。 Sr-BSA-rGO ナノシートを 100 μg/ml で MC3T3-E1 細胞を処理するために使用しました。（ d ）24、72および120時間のインキュベーション期間後、RT-PCRを使用してRUNX2およびCol 1A1発現レベルを検出し、それらの正規化をGAPDHに対して行った。

ここでは、GO、BSA-rGO、およびSr-BSA-rGOのALP活性も研究しました。ナノシートの濃度は一定（100 μg/ml）で、実験は 24、72、および 120 時間追跡されました。 Sr-BSA-rGOナノシートは、GOおよびBSA-rGOと比較してMC3T3-E1細胞のALP活性を増強し、この傾向は72時間および120時間にわたって同様であった（図8c）。 RT-PCR は、MC3T3-E1 細胞誘導 Sr-BSA-rGO の骨形成分化を評価するために利用されました。図8b、dに示すように、100μg/mlのSr-BSA-rGOでの処理は、RUNX2およびCol1A1遺伝子の発現を有意に増強した。興味深いことに、ALP 活性と MTT アッセイでも同様の傾向が観察されました。 120 時間の Sr-BSA-rGO 処理後、MC3T3-E1 細胞は 100 μg/ml の濃度で最高レベルの ALP 活性を示しました。総合すると、これらの実験は、100 μg/ml Sr-BSA-rGO が MC3T3-E1 細胞の骨形成分化に対して最も顕著な効果を誘発することを明らかにしました。

簡単に言うと、タンパク質ベースの還元/修飾に従って、BSA を介して Sr 修飾 rGO ナノシートを in situ 合成するための簡単なアプローチを提案しました。 UV-Vis、ラマン、XRD、FTIR 分光法により、BSA が rGO ナノシート表面の SrNP の還元と修飾に主な役割を果たしていることが示されました。 SEM および TEM 画像により、BSA-rGO の顕著な表面積上に SrNP が堆積していることが確認されました。 Sr-rGO ナノシートで処理した後、MC3T3-E1 細胞は GO および BSA-rGO と比較して ALP 活性の増強を示し、この傾向はそれぞれ 72 時間および 120 時間の処理で観察されました。 GO および BSA-rGO と比較して、MTT 実験における Sr-BSA-rGO ナノシートの細胞毒性は、最高の細胞生存率を示しました。 Sr-BSA-rGO で 120 時間処理した後、MC3T3-E1 細胞は 100 μg/ml で最高レベルの生物活性を示しました。全体として、この研究は、100 μg/ml Sr-BSA-rGO が MC3T3-E1 細胞の骨形成および骨形成分化に対して最も顕著な影響を確立したことを実証しました。合成ハイブリッドナノ生体材料の使用は、組織再生の状況において骨代替生体材料を提供するための実行可能なルートを提供する可能性があると思われる。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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これらの著者は同様に貢献しました: Hossein Akbari と Esfandyar Askari。

テヘラン大学化学工学部工学部、テヘラン、イラン

ホセイン・アクバリ & ゼイナブ・サレヒ

生体材料および組織工学研究グループ、融合技術部門、乳がん研究センター、モタメドがん研究所、ACECR、テヘラン、イラン

エスファンディヤル・アスカリ

イラン科学技術大学 (IUST)、先端技術学部、ナノテクノロジー学部、私書箱 16846-13114、テヘラン、イラン

エスファンディヤル・アスカリ & シード・モルテザ・ナギブ

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HA と EA は実験手順を実行しました。 SMN と ZS が監修し、アイデアを納得させ、原稿を修正しました。著者全員が原稿をレビューしました。

セイエド・モルテザ・ナギブへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

アクバリ、H.、アスカリ、E.、ナギブ、SM 他。ウシ血清アルブミンで修飾されたグラフェン修飾ストロンチウムは、骨組織工学用の強力な複合ナノ粒子です。 Sci Rep 12、12336 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-16568-7

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受信日: 2022 年 4 月 2 日

受理日: 2022 年 7 月 12 日

公開日: 2022 年 7 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16568-7

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