新規ポリペプチド

Scientific Reports volume 12、記事番号: 6624 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

生体分子で機能化された蛍光金ナノクラスター (AuNC) は、優れた生体適合性、安定した物理化学的特性、および大幅なコスト上の利点により、多くの注目を集めています。 Cu2+濃度が不適切だと、さまざまな病気を引き起こす可能性があります。この研究では、ウシ血清アルブミン (BSA) を鋳型として使用し、アルカリ水溶液中で AuNC を合成しました。次に、ペプチド CCYWDAHRDY を AuNC に結合しました。さらに、合成された CCYWDAHRDY-AuNC の Cu2+ に対する応答の蛍光を評価しました。結果から、CCYWDAHRDY-AuNC は Cu2+ を高感度に検出できることがわかりました。 Cu2+ をプローブシステムに添加した後、CCYWDAHRDY-AuNC の蛍光は消光されました。検出条件はpH 6、30°C、10分間で、Cu2+濃度と蛍光強度の間の直線関係は0.1〜4.2μmol/Lの範囲で良好でした。回帰式は y = − 105.9x + 693.68、線形相関係数は 0.997、最小検出限界は 52 nmol/L でした。

環境システムに重金属イオンが蓄積すると、環境や人間の健康に害を及ぼすリスクが高まります1、2、3、4、5。重金属イオンは酵素や核酸に容易に干渉し、生物の生物学的活動を変化させる可能性があります6。 Cu2+ は遷移金属として生物学において重要な役割を果たしており、生物の健康を維持するには Cu2+ の適切な摂取が必要です 7,8。しかし、Cu2+の濃度が不適切だと、さまざまな病気を引き起こす可能性があります。例えば、貧血や視力低下は Cu2+ の欠乏によって引き起こされる症状であり、過剰な Cu2+ 含有量はアルツハイマー病やパーキンソン病の悪化を促進する可能性があります 9,10,11,12,13。 Cu2+ は土壌や水中に広く分布しており、食物連鎖を通じて容易に人体に侵入します。 Cu2+ のリアルタイム監視は、食品の安全性と病気の予防の前提条件です 14,15。蛍光分光法、比色分析、電気化学分析およびガスクロマトグラフィーは、Cu2+16、17、18、19、20 の検出に適用されています。蛍光分析技術は、高感度、簡単な操作、速い検出速度により広く注目を集めています。ナノマテリアルと蛍光プローブの開発により、環境や食品中の汚染物質を検出するための蛍光センサーとしての金ナノクラスター (AuNC) が多くの研究者の注目を集めています 21,22。

AuNC は数十、さらには数百の金原子で構成されており、平均粒径は 2 nm 未満です 23,24。従来の蛍光色素や蛍光タンパク質と比較して、AuNC は、化学的不活性および超微細サイズによる生物の活性への影響が少なく、高い安定性、低毒性、および高い生体適合性などの優れた特性を備えています25。さらに、AuNC はストークスシフトが大きく、蛍光発光が強い 26。多価金属カチオンを添加すると、カルボキシル基と金属イオンの相互作用により AuNC 表面の Au-S 結合が破壊され、発光消光が起こります 27,28。

AuNC の蛍光特性は、適切なリガンドと生体適合性の足場を使用することで調整できます 29,30。これまでの研究では、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、チオール、核酸、その他の生体分子をリガンドとして使用して AuNC を調製できることが示されており、これらは高度な生体適合性を持ち、生体物質の干渉のない検出に使用できます 31,32,33。 34. 特に、ペプチドは、その特殊な三次元構造、調整可能な配列、便利な合成、および経済的な価格により、生体適合性および機能性金属ナノクラスターの合成によく使用されます。例えば、Yuan らは、GSH 長鎖ペプチド核酸で保護された Au25 NC と、電子が豊富な -COOH 基および -NH2 基がより強い発光を生成することを比較しました 35。システイン (C) は良好な配位能力 36 を持ち、チロシン (Y) は金属イオンを還元する強い能力 37 を持ち、通常、C と Y は AuNC を調製するためにペプチド配列に導入されます。特定のペプチドを AuNC と結合させると、毒性の高いイオンを迅速かつ効果的に検出できます。たとえば、CCYR6H4-AuNCs 生物発光センサーは検出限界を下げ、水中の Hg2+ に対する選択性を向上させます 38。

Cu2+ の蛍光消光挙動により、蛍光プローブは Cu2+ のアッセイに適用できます。この研究では、水中の細胞内 Cu2+ を検出するために、CCYWDAHRDY-AuNC の新規蛍光プローブを合成しました。まず、BSAを還元剤および安定剤として使用してAuNCを調製し、次にCCYWDAHRDY溶液とAuNCを撹拌し、25℃で24時間インキュベートしてCCYWDAHRDY-AuNCを得ました。さらに、Cu2+ に対する CCYWDAHRDY-AuNC 応答の特異性を評価しました。

すべての金属イオン (つまり、Cu2+、Pb2+、Zn2+、Ni2+、およびカリウム) は Sigma (米国ミズーリ州セントルイス) から購入しました。クロロ金酸 (AuCl3・HCl・4H2O)、リン酸水素ナトリウム (Na2HPO4)、およびリン酸二水素ナトリウム (NaH2PO4) は、Sinopharm Chemical Reagent Company (上海、中国) から入手しました。ウシ血清アルブミン (BSA) は、Changchun Dingguo Reagent Co., Ltd. (吉林省、中国) から購入しました。ペプチド CCYWDAHRDY は、GL Biochem (Shanghai) Ltd (上海、中国) から購入しました。すべての化学物質は分析試薬グレードであり、さらに精製せずに直接使用しました。実験全体を通じて蒸留水を使用しました。

すべてのガラス製品は、使用前に新たに調製した王水溶液 (HCl:HNO3 体積比 = 3:1) で洗浄し、蒸留水で十分にすすぎました。まず、10 mmol/L HAuCl4 水溶液 5 mL と 50 mg/mL BSA 溶液 5 mL を 37 ℃で 5 分間撹拌混合しました。次に、１ｍＬの１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨを上記混合物に添加した。そして、混合物を３７℃で２４時間撹拌して、ＡｕＮＣ粗生成物を得た。さらに、AuNC粗生成物を蒸留水中で透析して過剰な大きな粒子を除去し、AuNCを得た。

私たちの研究で設計したペプチド CCYWDAHRDY は、FMOC 保護アミノ酸合成法 39 を使用した固相手順によって合成されました。 CCYWDAHRDY -AuNC の合成は、以前の研究で説明された方法によって実行されました 40。まず、CCYWDAHRDY粉末を超純水に溶解し、1mg/mLのCCYWDAHRDY水溶液を得た。次に、0.5 mLのCCYWDAHRDY水溶液を2 mLのAuNCs溶液に加えました。上記の混合物を25℃で24時間穏やかに撹拌してCCYWDAHRDY-AuNCs溶液を得、これを暗所で4℃で保存した。

AuNC および CCYWDAHRDY-AuNC の蛍光強度は、RF5301 蛍光分光光度計 (島津企業管理 (中国) 有限公司) を使用して測定しました。 AuNC および CCYWDAHRDY-AuNC の形状とサイズは、FEI Titan ETEM G2 透過型電子顕微鏡 (Shanghai Zhengfei Electronic Technology Co. Ltd.) を使用して分析されました。また、紫外吸収スペクトルは、UV1800 紫外可視分光光度計 (Shanghai Precision Instrument Co. Ltd.) を使用して測定しました。

0.1 mL の CCYWDAHRDY-AuNCs 溶液と、異なる pH 値、つまり 4、5、6、7、8 のリン酸緩衝食塩水 (PBS) 溶液 0.84 mL を混合し、次に 60 μmol/L Cu2+ 標準溶液 0.06 mL を加えました。。続いて、混合物の蛍光強度を測定した。対照群では、Cu2+標準溶液をPBS溶液に置き換え、その後、混合物の蛍光強度を測定した。

0.1 mLのCCYWDAHRDY-AuNCs溶液と0.84 mLのリン酸緩衝食塩水(PBS)溶液を混合し、次に0.06 mLの60 μmol/L Cu2+標準溶液を加えた。次に、混合物の蛍光強度を異なる温度(すなわち、10、20、30、40および50℃)で測定した。対照群では、Cu2+標準溶液をPBS溶液に置き換え、その後、混合物の蛍光強度を測定した。

0.1 mL の CCYWDAHRDY-AuNCs 溶液と 0.84 mL のリン酸緩衝食塩水 (PBS) 溶液を混合し、次に 0.06 mL の 60 μmol/L Cu2+ 標準溶液を加え、その後、異なる反応時間での混合物の蛍光強度 (つまり、続いて、0、5、10、15、20、25、30分）を測定しました。対照群では、Cu2+標準溶液をPBS溶液に置き換え、その後、混合物の蛍光強度を測定した。

CCYWDAHRDY-AuNC (100 μL) を、PBS 緩衝液 (pH = 6) 中で異なる濃度の Cu2+ (つまり、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、および 4.2 μmol/L) 0.06 mL と混合しました。反応系は1mLです。混合物を30℃で10分間インキュベートした。次に、スペクトル走査を実行し、蛍光分光光度計に記録しました。 Cu2+ 濃度の検出曲線は、蛍光効率 (F0/F) を縦軸として作成されました。Ｆ０およびＦはそれぞれ、Ｃｕ２＋の非存在下および存在下における溶液系の最大蛍光強度を示した。 Cu2+ を含む AuNC の蛍光強度も記録されました。

異なる濃度の干渉を含む Cu2+ を含む試験溶液の蛍光強度を測定しました。次の金属イオンが使用されました: Co2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、K+、Na+、Pb2+。

データは平均値 ± SD (n = 3) として表され、差は、SPSS (SPSS Inc.、シカゴ、イリノイ州、米国) を使用して、一元配置 ANOVA 検定に続いて最小有意差 (LSD) 検定によって実行されました。

BSAは合成反応の還元剤およびクラスターの保護剤として使用されました。図1(a)に示すように、この曲線はAuNCの520 nm付近に特徴的な吸収ピークを示さなかったため、AuNCの合成中にナノ結晶が生成されず、これはAuNCが粒径が小さく、良好な特性を持っていることを示しました。分散した。図1(b)に示すように、合成されたAuNCは可視光下では薄茶色/黄色で、350 nm UVランプの照射下では強いオレンジ色の蛍光を発しました。 AuNC の平均粒子サイズは約 1.8 nm で、分散性は良好で粒子の凝集はありませんでした [図 1(c) に示す]。これは以前の報告と一致していました 41,42。

AuNC の特性評価：（a）AuNC の紫外可視吸収スペクトル、（b）AuNC の写真（左側の写真は日光下、右側の写真は 350 nm UV ランプを示しています）、（c） ) AuNC の TEM 写真、(d) 励起波長 260 nm における AuNC の蛍光発光スペクトル。

図1(d)に示すように、AuNCの最大発光波長は650nmでした。 BSA 修飾 AuNC は Au0-Au1 コアシェルナノ構造を持ち、蛍光リガンドと Au+ の間の電荷移動によって蛍光が発生しました。 BSA のチロシン残基には、アルカリ条件下で Au+ を Au に還元する能力がありました。同時に、BSA のシステイン残基は Au-S 結合を介して系内の AuNC を捕捉することができ、BSA は反応系の安定性を高めました。

図 2(a) は、CCYWDAHRDY が AuNC と結合した場合、システムの分散性が変化しないことを示しています。粒子サイズに明らかな変化はなく、凝集も発生しなかったことから、この系が強い蛍光発光と安定した特性を有することが示唆されました。紫外可視吸収スペクトルを使用して、AuNC および CCYWDAHRDY-AuNC の光学的特性と構造を調査しました。図２（ｂ）に示すように、ＡｕＮＣのスペクトルは、ＣＣＹＷＤＡＨＲＤＹとの結合後も変化しなかった。私たちの実験で使用した CCYWDAHRDY は、AuNC の特性に影響を与えることなく AuNC を変更することに成功しました 38。図3(a)から、CCYWDAHRDYと結合したAuNCは自然光下ではAuNCよりもわずかに暗かったが、紫外光下でのCCYWDAHRDY -AuNCのオレンジ〜赤色の蛍光発光はAuNCの蛍光発光とほぼ同様であったことが観察されました。。

CCYWDAHRDY-AuNC の特性評価：（a）CCYWDAHRDY-AuNC の TEM 写真、（b）AuNC および CCYWDAHRDY-AuNC の紫外可視吸収スペクトル。

AuNC および CCYWDAHRDY-AuNC の蛍光強度: (a) 日光下 (左) および 350 nm UV ランプ下 (右) での AuNC (1) および CCYWDAHRDY-AuNC (2) の写真、(b) 蛍光発光スペクトル260 nm の励起波長における AuNC と CCYWDAHRDY-AuNC の結果。

CCYWDAHRDY-AuNC の蛍光を AuNC の蛍光と比較しました。図3(b)に示すように、CCYWDAHRDYを結合した後、AuNCの蛍光は大幅に増加しました。おそらく CCYWDAHRDY には機能的なトリペプチド鎖 CCY が含まれており、チロシンのフェノール基が三価の金イオンを金原子に還元することができ、システインが AuNC を捕捉して CCYWDAHRDY が AuNC に結合できる可能性があると考えられます。さらに、CCYWDAHRDY内の電子豊富な酸素原子または窒素原子とリガンド内の官能基（カルボキシル基およびアミノ基）は電子移動を効果的に強化し、それによってCCYWDAHRDYによって修飾されたAuNCの蛍光強度を増加させることができます。 CCYWDAHRDY のトリプトファン (W) には強力な還元能力があり、AuNC の形成を促進し、蛍光強度を増加させることができます。同時に、CCYWDAHRDY は適切な安定剤として機能し、AuNC の蛍光をさらに保護し、それにより外部環境要因によって引き起こされる大きな粒子への AuNC の凝集を回避し、AuNC の蛍光安定性を高めました。

最適な実験条件を選択するための主な要素には、pH、温度、反応時間が含まれます。最良の反応条件を検出するために、650 nm の励起波長と 60 μmol/L Cu2+ 標準溶液が使用されました。図4(a)に示すように、CCYWDAHRDY-AuNCの蛍光応答に対するさまざまなpH値の影響が研究され、実験システムのpHが最適化されました。系のｐＨが６のとき、蛍光強度比Ｆ０／Ｆが最も高かった。 pHが上昇すると、F0/Fは安定し、わずかに減少しました。したがって、pH 6.0 の PBS バッファーが最適な検出条件として選択されました。

Cu2+ 消光の効果に対するさまざまな環境要因の影響 CCYWDAHRDY-AuNC 蛍光: (a) 異なる pH 値での CCYWDAHRDY-AuNC の Cu2+ に対する蛍光発光強度、(b) 異なる pH 値での Cu2+ に対する CCYWDAHRDY-AuNC の蛍光発光強度温度、(c) CCYWDAHRDY-AuNC から Cu2+ への蛍光発光強度の時間の経過に伴う変化。

温度は蛍光消光システムにおいて支配的な役割を果たしました。検出に対する温度の影響を調査した。図４（ｂ）に示すように、温度が１０℃から３０℃に上昇すると、蛍光強度比Ｆ０／Ｆは徐々に増加し、３０℃で蛍光強度比Ｆ０／Ｆが最大となった。温度が上昇し続けると、焼入れ率は徐々に低下しました。したがって、30 °C が最適な検出温度でした。

Cu2+によるCCYWDAHRDY-AuNCの蛍光消光を反応時間の関数として研究しました（図4c）。反応の蛍光強度は 0 ～ 5 分以内に急速に減少しました。蛍光強度は時間の経過とともに減少しました。 10 分後、蛍光は比較的安定したままであり、大幅には減少しませんでした。したがって、10 分が最適な反応時間であると考えられました。

CCYWDAHRDY と AuNC の結合に成功すると、Cu2+ の高感度モニタリングが実現できる可能性があります。トリペプチド配列 DHA は、窒素原子を介して Cu2+ と軌道上で重なり、安定した平面構造を形成することができ、これにより Cu2+ を同定するという目的を達成できる可能性があります。最適な反応条件下の CCYWDAHRDY-AuNC を使用して、Cu2+ を定量的に検出しました。図5に示すように、0.1〜4.2μmol/Lの範囲のCu2+濃度では、CCYWDAHRDY-AuNCs蛍光システムに添加されるCu2+の濃度が増加すると、CCYWDAHRDY-AuNCsの蛍光強度とF0/Fは徐々に減少します。 F0/F と Cu2+ 濃度の間には直線的な相関関係があります。線形回帰式は y = − 105.9x + 693.68 で、相関係数は 0.997 でした。 S/N = 3 の最小検出限界は 52 nmol/L でした。表 1 に示すように、以前の研究と比較して、CCYWDAHRDY-AuNC によって検出される Cu2+ のアッセイの検出限界は低かった。これは、世界保健機関 (WHO) と米国環境保護庁 (EPA) が設定した飲料水中の Cu 2+ の最大許容濃度 (それぞれ 20 μmol/L、30 μmol/L) よりも低いです。一般に、CCYWDAHRDY-AuNC は、Cu2+ の測定に幅広い応用の可能性を秘めています。

異なる Cu2+ 濃度に対する CCYWDAHRDY-AuNC の蛍光応答。

図6に示すように、Cu2+濃度に対するCCYWDAHRDY-AuNCの応答曲線の傾きはAuNCの応答曲線よりも大きく、CCYWDAHRDY-AuNCの感度が高いことが示されました。トリペプチド配列 DAH は Cu2+ と安定な平面構造を形成することができました。したがって、蛍光検出システム全体において、CCYWDAHRDY-AuNC はより高感度に Cu2+ を認識できます。

AuNC および CCYWDAHRDY-AuNC の、さまざまな濃度の Cu2+ に対する蛍光応答。

CCYWDAHRDY-AuNCs 測定システムの Cu2+ に対する選択性を評価するために、蛍光応答に対する他の金属イオン、つまり Co2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、K+、Na+、および Pb2+ の影響を検出しました。図7に示すように、他の金属イオンを添加しても、他の干渉イオンの濃度がCu2+の10倍であっても、CCYWDAHRDY-AuNCの蛍光は大幅に消光されませんでした。したがって、この方法は良好な感度と選択性を備えています。調製された CCYWDAHRDY-AuNC は優れた蛍光性と安定性を備えているため、テスト結果の再現性が保証されます。

さまざまなイオンを添加したときの CCYWDAHRDY-AuNC の蛍光応答。 Cu2+ の濃度は 60 μmol/L、その他の金属イオンの濃度は 600 μmol/L でした。

要約すると、CCYWDAHRDY 配列が設計され、CCYWDAHRDY-AuNC の合成に成功しました。最適合成条件はpH6.0、反応時間10分、焼成温度30℃であった。 CCYWDAHRDY-AuNCはCu2+に対して高い選択性を示し、最小検出限界は52nmol/Lで、Cu2+とCCYWDAHRDY-AuNCの蛍光強度は0.1〜4.2μmol/Lの範囲で直線でした。 AuNC と比較して、CCYWDAHRDY-AuNC による Cu2+ の検出はより感度が高く、高い特異性でした。これらの結果は、合成された CCYWDAHRDY-AuNC が Cu2+ の検出に使用できることを示しました。

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この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (2018YFC1602205-2) および吉林省科学技術開発計画プログラム (20190301027NY) によって支援されました。

吉林大学食品科学工学院、No. 5333 Xi'an Road、Changchun、130062、中国

Hon Zhuang、Xinyu Jiang、Sijia Wu、Shujin Wang、Yong Pang、Yanjun Huang、Haiyang Yan

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転載と許可

Zhuang, H.、Jiang, X.、Wu, S. 他銅イオン検出用の新しいポリペプチド修飾蛍光金ナノクラスター。 Sci Rep 12、6624 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-10500-9

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受信日: 2021 年 9 月 6 日

受理日: 2022 年 4 月 4 日

公開日: 2022 年 4 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10500-9

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蛍光ジャーナル (2022)

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