多感覚学習はニューロンを十字に結びつける

Nature volume 617、pages 777–784 (2023)この記事を引用

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94 オルトメトリック

メトリクスの詳細

複数の感覚手がかりを物体や経験と関連付けることは、物体の認識と記憶のパフォーマンスを向上させる基本的な脳のプロセスです。 しかし、学習中に感覚特徴と結合し、記憶発現を増強する神経機構は不明です。 今回我々は、ショウジョウバエにおける多感覚の食欲記憶と嫌悪記憶を実証する。 色と匂いを組み合わせると、それぞれの感覚モダリティを単独でテストした場合でも、記憶能力が向上しました。 神経機能の時間的制御により、多感覚訓練後の視覚と嗅覚の両方の記憶の強化には視覚選択的なキノコ体ケニオン細胞（KC）が必要であることが明らかになった。 頭部を固定したハエの電圧イメージングにより、多感覚学習がモダリティ固有のKCの流れ間の活動を結びつけ、単峰性の感覚入力が多峰性の神経反応を生成することが示された。 結合は、価数に関連したドーパミン作動性強化を受け取る嗅覚および視覚KC軸索の領域間で起こり、下流に伝播します。 ドーパミンは局所的にGABA作動性阻害を解除し、KCにまたがるセロトニン作動性ニューロン内の特定の微小回路が、以前は「モダリティ選択的」だったKCストリーム間の興奮性の架け橋として機能できるようにする。 したがって、クロスモーダル バインディングは、各モダリティの記憶エングラムを表す KC を、他のモダリティを表す KC に拡張します。 このエングラムの拡張により、多感覚学習後の記憶性能が向上し、単一の感覚機能で多峰性の経験の記憶を呼び出すことが可能になります。

ほとんどの動物にとって、人生は豊かな多感覚体験です。 その結果、神経系は、行動を最も効果的に導くために、物体、場面、出来事の多感覚表現を使用するように進化しました1。 多感覚学習が記憶能力を向上させることは、教室での子供から、管理された実験室でのげっ歯類や昆虫に至るまで、広く認識されています2、3、4、5。 さらに、多感覚学習の明らかに普遍的で説明されていない特徴は、別々の単感覚要素であってもその後の記憶パフォーマンスを向上させることです3,5。 人間や他の哺乳類を対象とした研究では、多感覚学習はトレーニング中に共同活動していたモダリティ固有の皮質間の相互作用から利益を得ること、そして個々の感覚がテスト時に両方の領域を再活性化できることが示唆されています3,6,7,8,9。 さらに、異なる脳領域の細胞は複数の感覚刺激に反応し、多感覚学習後にその割合や数が変化します1、10、11、12。 しかし、現時点では、多感覚学習によってニューロンがどのようにモダリティ選択的から多峰性へと変換されるのか、またそのようなプロセスによって多感覚および単感覚の記憶性能がどのようにサポートされるのかについて、詳細なメカニズムの理解が不足しています。

ショウジョウバエでは、キノコ体 (MB) KC の独特な集団が、嗅覚または視覚投射ニューロン (および局所視覚介在ニューロン) から主に解剖学的に分離された樹状突起入力を受け取り、その軸索が平行な流れとして MB 葉に投射します。 そこでは、各KCの軸索樹の連続する区画が、食欲または嫌悪刺激の強化効果を伝えるドーパミン作動性ニューロン(DAN)のプレシナプスと交差しています13,14。 ドーパミンを強化すると、活性なKCと下流のMB出力ニューロンのコンパートメントに制限された樹状突起の間のシナプスが抑制され、価数特異的な記憶がコード化されます15、16、17。

ショウジョウバエの多感覚学習を研究するために、色と匂いを一緒に提示できるように嗅覚T-maze18を適応させました（図1a）。 餌を与えられなかったハエに、色および/または匂い（条件刺激マイナス（CS-））を提示し、続いて別の色および/または匂い（条件刺激プラス（CS+））を砂糖報酬と組み合わせて提示することによって訓練した（図​​1）。 1a、b)。 色のみで訓練およびテストした場合（視覚学習）、ハエは以前に砂糖とペアになった色に対する顕著な学習された好みを示さなかった（図1b〜dおよび拡張データ図1a）。 しかし、色と匂いを組み合わせると（一致プロトコル）、堅牢で長期的な記憶が生成され、匂いのみを使用したトレーニング（嗅覚学習）によって形成された記憶よりも大幅に強化されました（図1b〜dおよび拡張データ図1a、b）。 色と匂いの組み合わせがトレーニングとテストの間で交換された場合（不一致プロトコル）（図1b〜dおよび拡張データ図1a、b）、記憶の強化は観察されませんでした。 さらに、トレーニングおよびテスト中に同じ色がCS-およびCS+の匂いで提示された場合、記憶の強化は明らかではありませんでした（拡張データ図1c）。 したがって、多感覚学習の記憶増強効果には、特定の色と匂いの組み合わせの間の学習された関係が必要です。 訓練の6時間後に測定された記憶については、不一致のプロトコルでは、嗅覚学習後のものと比較してパフォーマンスが大幅に低下していることが明らかになり（図1d）、これは、訓練とテストの間で色と匂いの偶発性が切り替わったときにハエが矛盾していることを示唆しています。

a、多感覚のトレーニングとテストのための装置 (左)、および実験タイムライン (右)。 b. プロトコル。 緑と青の四角は色を表し、明るい灰色と濃い灰色の四角は 3-オクタノール (OCT) と 4-メチルシクロヘキサノール (MCH) の匂いを表します。 視覚（V）学習の場合、色は CS+ および CS- として使用されました。 嗅覚（O）学習では、匂いを CS+ および CS- として使用しました。 一致する (C) プロトコルでは、色 + 匂いが CS+ および CS- として組み合わされ、同じ色 + 匂いの組み合わせがトレーニングとテストに使用されました。 不一致 (I) プロトコルでは、色と匂いを CS+ および CS- として組み合わせましたが、トレーニングとテストの間で組み合わせを切り替えました。 嗅覚検索 (OR) の場合、トレーニングには色と匂いの組み合わせが使用されましたが、テストには匂いのみが使用されました。 視覚検索 (VR) の場合、トレーニングには色と匂いの組み合わせが使用されましたが、テストには色のみが使用されました。 c、d、トレーニングとテストのタイムライン（上）、V、O、C、および I プロトコルの即時（c）および 6 時間（d）のメモリ（下）。 e、f、タイムライン（上）、および個々のモダリティごとにトレーニング直後（e）および6時間後（f）にテストされた色と匂いによる多感覚トレーニング（下）。 アスタリスクは有意差を示します (P < 0.05)。 データは平均値±標準誤差として表示されます。ドットとして表示された個々のデータ点は独立した実験に対応します。 グループは、一元配置分散分析 (ANOVA) とテューキー検定 (c、d) および対応のない両側 t 検定 (e、f) を使用して比較されました。 正確な P 値と比較は補足情報に記載されています。 V の場合は n = 8、O、C、および I の場合は n = 10 (c)。 n = 10 (d); n = 10 (e); O と OR の場合は n = 14、V と VR の場合は n = 10 (f)。

多峰性記憶の強化をさらに調査するために、多感覚刺激の提示をトレーニングまたはテストのいずれかに限定しました。 多感覚トレーニングは、テスト中に各モダリティが単独で提示された場合でも記憶想起を改善しました（嗅覚想起と視覚想起）（図1e、f）。 対照的に、テスト中にのみ多感覚刺激を提示しても、パフォーマンス（多感覚検索）は促進されませんでした（拡張データ図1d）。 さらに、トレーニングとテスト中に多感覚刺激を使用したときに、パフォーマンスの最大の向上が観察されました（拡張データ図1e）。 したがって、多感覚トレーニングは、個々の色と匂いの記憶要素の記憶能力を向上させ、トレーニングとテストの間の色と匂いの情報の一致により、パフォーマンスがさらに向上します。 私たちの実験や他の場所19は、ハエが緑と青の色を区別していることを示唆していますが、色相と輝度の寄与を無視するものではありません。

αβ 葉、α'β' 葉、および γ 葉内の嗅覚 KC の数的に大きな集団 (つまり、γ メイン (γm KC)) の樹状突起が MB の主要な萼を占有するのに対し、比較的小さな集団はαβ後部（αβp）およびγ背部（γd）のKCは、副萼の樹状突起を介して主に視覚情報を受け取ります14。 γd KC は以前、色の学習に関与していると考えられていました 19,20。 我々は、優勢な温度感受性ダイナミン21をコードするUAS-Shibirets1（Shits1）導入遺伝子の細胞特異的発現を用いて、多感覚学習と記憶における視覚γdおよびαβpKCの役割をテストした。 30℃を超える温度では、Shits1は膜のリサイクルをブロックし、シナプス伝達を損なうが、ハエを29℃未満に戻すことで機能を回復できる。 6 時間の試験中に γd および αβp KC からの出力をブロックすると、一致するプロトコルでのパフォーマンスの視覚的な向上がなくなり、不一致の干渉が除去されました。 どちらの場合も、記憶能力は匂いのみでテストしたハエの記憶能力と同様でした（図2a～dおよび拡張データ図2a～f）。 これらの結果は、γdおよびαβp KCの活性が多感覚記憶の視覚的要素を表すことを示唆しています（拡張データ図2g、hも参照）。 テスト中にγd KC（αβp KCではない）出力をブロックすると、匂いのみで訓練されたハエの記憶想起には影響しなかったにもかかわらず、多感覚訓練されたハエの匂いのみの記憶想起のパフォーマンスが損なわれました22（拡張データ図） .2a、d)。 この予期せぬ結果により、多感覚学習により匂いの表現が「視覚的」γd KC を含むように拡張される可能性があるという仮説が立てられました。

a、γd KCの概略図（左上）、および温度変化を伴うタイムライン（破線）（左下）。 一致するプロトコルで MB607B-GAL4;UAS-Shits1 を使用したテスト中の γd KC のブロック出力も示されています (右)。 b、不一致のプロトコルでのテスト中のγd KCの出力のブロック。 c、αβp KCの概略図（左上）、および温度変化のタイムライン（左下）。 一致するプロトコルで c708a-GAL4;UAS-Shits1 を使用したテスト中の αβp KC の出力のブロックも示します (右)。 d、不一致プロトコル中のαβp KCの出力のブロック。 e、f、温度変化のタイムライン（上）、および多感覚記憶の嗅覚想起のテスト中のγd（e）およびαβp（f）KCの出力の遮断（下）。 アスタリスクは有意差を示します (P < 0.05)。 データは平均値±標準誤差として表示されます。ドットとして表示された個々のデータ点は独立した実験に対応します。 すべてのグループは、一元配置分散分析とテューキー検定を使用して比較されました。 正確な P 値と比較は補足情報に記載されています。 n = 12 (a、b、d、f) および n = 10 (c、e)。 コントロールについては、拡張データの図 2 を参照してください。

多感覚トレーニング後のγd KCにおける学習された匂い誘発反応を直接テストするために、γd KCで電圧センサーUAS-ASAP2f23を発現させ、二光子機能イメージングを実行しました（図3a〜dおよび拡張データ図3a、b、f） 、g）。 ハエは、多感覚（色 + 匂い）、一感覚（匂い）、または不対（色 + 匂いの 2 分後に砂糖を提示）のトレーニングを受けました。 訓練の 6 時間後、ハエの CS+ および CS- 臭気反応を画像化しました。 γd KC軸索の記録は、糖報酬DANがγ4およびγ5コンパートメントのKC-MB出力ニューロンシナプスの学習に関連したシナプス前抑制を駆動するため、MB水平葉の末端γ5コンパートメントで行われました。 比較のために、嫌悪教育信号を提供するDANのシナプス前野を収容する近位γ1コンパートメント内のγd KCの応答を画像化しました26、27、28。 匂いの提示は、ナイーブなハエのγd19 KC および αβp22 KC でゆっくりとした阻害を引き起こすことが以前に示されています。 CS-臭気の提示は、トレーニングプロトコルに関係なく、γ1およびγ5コンパートメントの両方でγd KCの過分極​​を引き起こすことがわかりました（図3a〜dおよび拡張データ図3a、b、薄紫色のトレース）。 しかし、多感覚訓練後、CS+臭気はγ5コンパートメントのγd KC軸索の顕著な脱分極を引き起こしました（図3a、濃い紫色のトレース）。 γ1 コンパートメントにおける CS+ 応答は、おそらくハエの空腹状態によって PPL1-γ1pedc DAN が調節されているため、CS- に対する応答よりも抑制性が低いように見えました (図 3b; 応答は統計的に区別できませんでした)。 γ5 における γd KC 臭気反応の多感覚トレーニングによる符号反転は、単感覚臭気のみのトレーニング (図 3c、濃い紫色のトレース) または不対トレーニング (拡張データ 図 3a、濃い紫色のトレース) 後には発生しませんでした。 これらの場合、CS+とCS-の両方の臭気がγ1およびγ5コンパートメントで過分極を引き起こしました（図3c、dおよび拡張データ図3a、b）。 色誘発シグナルをイメージングすると、ナイーブハエのγd KCにおける両方の色に対する強い応答が明らかになりました（拡張データ図3c）。 γm KCを記録すると、多感覚トレーニング後のCS +色による顕著なγ5コンパートメント制限された興奮の利得が明らかになり、γ1コンパートメントの応答は変化しませんでした（図3e、f;レーザースキャン画像検出は、実行中にシャッターによってブロックされることに注意してください）カラープレゼンテーション)。 これらのイメージング実験に必要なパルス色光は、多感覚学習と視覚検索（拡張データ図3d、e）や匂いに対するγm KC反応（拡張データ図3h、i）を損なうことはありませんでした。 これらの結果は、ドーパミン作動性報酬教示信号が、γd KC軸索のγ5セグメントを動員して匂い活性化し、γm色活性化することにより、γ-KCアンサンブル内のCS +匂い誘発およびCS +色誘発興奮を広げることを示しています（図3g）。 これらのより大きな色と匂いの記憶エングラムは、多感覚トレーニング後に匂いと色の記憶パフォーマンスがどのように強化されるかのメカニズムを提供し（図1e、f）、この文脈での匂い記憶の検索がγd KC出力の要件を獲得する理由を説明します（図2e） ）。

パネル a ～ f では、食欲多感覚 (色 + 匂い) または食欲一感覚 (匂い) トレーニング後の匂いまたは色反応イメージングのタイムライン (左上)。 γd または γm KC 軸索の γ5 または γ1 領域のいずれかの撮像面 (左下)。 CS+ および CS- の臭気誘発活動の痕跡 (中央)。 および応答の定量化 (右) が示されています。 a、γd KC軸索のγ5領域は、多感覚トレーニング後にCS+臭気に対する興奮性反応を示しました（蛍光の減少により、ASAP2f電圧センサーの-ΔF / F0が増加します）。 γ5 軸索は CS- 臭気によって阻害されました (-ΔF/F0 の減少)。 b、CS+臭気に対する興奮性反応はγ1では観察されず、CS-臭気が抑制を誘発した。 c、d、γ5（c）領域とγ1（d）領域の両方が、食欲的単感覚（匂い）トレーニング後にCS+およびCS-の匂いに対する抑制を示しました。 e、γm KC軸索のγ5領域は、多感覚トレーニング後にCS+色に対してのみ興奮性反応を示しました。 f、γ1ではCS+色への励起は観察されなかった。 この研究のすべてのトレースと定量化について、CS+ データは、試験の半分が CS+ として青または MCH を使用し、残りの半分が CS+ として緑または OCT を使用した平均応答に対応します。 CS−データについても同様です。 匂いまたは色によって誘発された活動追跡は、平均値 (実線) と標準誤差 (影) を示します。 水平の破線はベースライン アクティビティを示します。 a ～ d では、下の黒い実線のトレースは 5 秒間の臭気曝露を示しています。 e および f では、垂直の灰色のバーは、画像取得がシャッタリングされたときの 0.75 秒のカラー表示に対応し、点線のボックスは 1.75 秒の定量化期間に対応します。 アスタリスクは、平均した CS+ 応答と CS- 応答間の有意差を示します (P < 0.05)。 各ハエの CS+ および CS- 応答は破線で結ばれています。 すべてのグループは、対応のある両側 t 検定を使用して比較されました。 正確な P 値と比較は補足情報に記載されています。 n = 26 ハエ (a、b); n = 24 ハエ (c); n = 22 ハエ (d); n = 16 ハエ (e、f)。 g、食欲的多感覚色 + 匂いトレーニングとその後の単感覚匂いまたは色のテストのための MB モデル。 γm KCは樹状突起の嗅覚入力とγd 視覚入力を受け取ります。 どちらの γ-KC タイプも、MB γ 葉の γ1 ～ γ5 コンパートメントを介して軸索を投影します。 食欲トレーニング（左）は、γ4 と γ5 を神経支配する報酬 DAN（緑色）に関与し、放出されたドーパミンは、匂いで活性化された KC と回避指示 MB 出力ニューロン（図示せず）の間のシナプス 49 を抑制することによって学習をコード化します 14。 多感覚学習中のドーパミンシグナル伝達は、γ4 ～ γ5 コンパートメントの γm および γd KC 活性にも結合します。 今後の知覚臭気テスト中（中央）、CS+ 臭気は特定の γm KC を興奮させ（太い灰色の矢印）、これが次に γ4 ～ γ5 コンパートメントの γd 軸索を活性化します（灰色の破線から黄色）。 γd を介したγm KC の逆活性化は、単感覚色検査で起こります (右)。

γd KC細胞体の電圧イメージングでは、多感覚報酬トレーニング後の匂いの活性化は示されず（拡張データ図3f、g）、匂いに応答するこれらのニューロンの学習駆動型補充は、樹状突起入力の強化によっては起こらないことを示唆しています。 したがって、我々は軸索リクルートメントのモデルをさらにテストしました。 私たちは、DAN が γd 軸索の動員を指示して匂いが活性化される (そして γm 軸索が色が活性化される) 場合、最も近位の γ1 葉コンパートメントを神経支配する PPL1-γ1pedc DAN からのドーパミン放出を必要とする嫌悪学習事象が匂いを与えるはずであると推論しました。 γ1 から γ5 までのすべての下流 γd 軸索セグメントに対する応答性。 多感覚の色と匂いの嫌悪（電気ショック）トレーニングは、食欲トレーニング後に観察されたものと同様に、組み合わせた合図と個別の合図の両方について記憶強化を引き起こし（拡張データ図4a-f）、匂いの記憶にはγd KCも必要であることを確認しました。嫌悪感のある多感覚トレーニング後の強化（拡張データ図4g–l）。 次に、二光子電圧イメージングを使用して、γ1以降のγd軸索が多感覚嫌悪学習後にCS +匂い活性化を獲得したかどうかをテストしました。 CS-匂いの提示は、トレーニングプロトコルに関係なく、γ1およびγ5コンパートメントの両方でγd KCの過分極​​を引き起こしました（図4a、bおよび拡張データ図4m–p、薄紫色のトレース）。 対照的に、多感覚嫌悪訓練後、CS+臭気はγ1およびγ5のγd KCの短時間の興奮を引き起こしました（図4a、b、濃い紫色のトレース）。 したがって、食欲的および嫌悪性の多感覚学習後のγd KCの匂い反応の記録、および食欲的多感覚学習後の色によって誘発されたγm KCの匂い反応の記録は、嗅覚刺激によって活性化されるγ-KC軸索の部分を決定するDAN教示信号の位置と一致する。他の CS+ モダリティ。 嫌悪学習により、γ1の下流のすべての軸索セグメントが相互モダリティによって興奮可能になります（図4c）が、報酬学習は主にγ4およびγ5セグメント内のCS +興奮を変化させます（図3g）。

a、b、嫌悪多感覚（色 + 匂い）トレーニングと匂いイメージングのタイムライン（左上）。 γd KC 軸索の γ1 (a) または γ5 (b) 領域の画像面 (左下)。 CS+ および CS- の臭気誘発活動の痕跡 (中央)。 匂いによって引き起こされる反応の定量化 (右)。 γ1 領域は、嫌悪多感覚訓練後に CS+ 臭気に対して興奮し、CS- 臭気に対して抑制を示しました (a)。 CS+ 臭気は、CS- よりもγ1 での抑制を引き起こしませんでした (b)。 臭気誘発活性トレースは、平均値 (実線) と標準誤差 (影) を示します。 水平の破線はベースライン活動を示します。トレースの下の黒い実線は、5 秒間の臭気曝露を示します。 アスタリスクは、平均した CS+ 応答と CS- 応答間の有意差を示します (P < 0.05)。 各ハエの CS+ および CS- 応答は破線で結ばれています。 c、嫌悪感多感覚トレーニングとそれに続く臭気テストのための MB モデル。 嫌悪性多感覚トレーニング（左）は、γm と γd KC の間のシナプス 16,17 と接近指向性 γ1 と γ2 MB 出力ニューロン 16,17（図示せず）を抑制する罰 DAN（赤）を関与させ、同時にこれらのコンパートメントの γd および γm KC 活性にも結合します。 単一感覚匂いテスト (右) は、特定の γm KC を励起し、γ1 から先の γd 軸索を活性化します。 d、e、以前の嫌悪性多感覚学習は、将来の食欲性学習を強化しますが、嫌悪性匂い学習は強化しません。 プロトコルを示します (左)。 飢えたハエを、嫌悪性の多感覚訓練（グループ I）と嫌悪性の単感覚臭気訓練（グループ II）に分けました。 3 時間後、両グループは匂いと砂糖のご褒美でトレーニングを受け (最初のトレーニングと同じ CS+ または CS- の匂いを使用)、その直後にテストされました。 メモリのパフォーマンスも表示されます (右)。 最初に多感覚嫌悪プロトコルでトレーニングしたグループ I は、最初に匂いだけでトレーニングしたグループ II よりも優れたパフォーマンスを示しました (d)。 最初に多感覚食欲プロトコルで訓練されたグループ I は、最初に匂いのみで訓練されたグループ II を上回る成績を収めませんでした (e)。 アスタリスクは有意差を示します (P < 0.05)。 データは平均値±標準誤差として表示されます。ドットとして表示された個々のデータ点は独立した実験に対応します。 対応のある両側 t 検定 (a、b) および対応のない両側 t 検定 (d、e) を使用してグループを比較しました。 正確な P 値と比較は補足情報に記載されています。 n = 24 ハエ (a、b)、n = 12 (d)、および n = 8 (e)。

多感覚トレーニング後の CS+ 匂い表現の γd 軸索の特定のセグメントへの拡張は、次の DAN 教師信号が拡張された KC 表現と交差する場合、同じ匂いによるその後の学習を促進することが期待される可能性があります。 私たちは、嫌悪性（γ1のドーパミン）または食欲性（γ4およびγ5のドーパミン）多感覚プロトコルのいずれかでハエを連続的に訓練し、続いて単感覚の匂い報酬学習または匂い罰学習を行うことによって、この概念をテストしました（図4f、g）。 以前の多感覚嫌悪トレーニングは、その後の匂い報酬学習を大幅に強化しました（図4d）。 しかし、嫌悪臭学習が多感覚食欲学習に続いた場合、増強は明らかではありませんでした（図4e）。 したがって、適切なγd軸索セグメントがCS+匂い活性化された場合、CS+匂い表現の多感覚トレーニング依存の拡張を次のCS+匂い記憶エングラムに含めることができます。

MB ネットワークの解剖学的構造は、γd KC 軸索に匂い応答性を与える 2 つの考えられる方法を示唆しています。それは、KC-KC シナプスまたは異なる KC ストリームを架橋するように位置するニューロンを介することです。 我々は、1 羽の成体メスハエの「半脳」電子顕微鏡ボリュームの完全な MB コネクトームを使用して、これらのルートの解剖学的実現可能性を調べました 32,33。 ほとんど（590 個中 562 個）の γm KC は γd KC とシナプスを形成しますが、これらの接続の数と配置は、すべての γd KC がすべての γ ローブ コンパートメントで γm 入力を受け取ることをサポートしているわけではありません。 さらに、KC-KC 接続は隣接する KC の活動を抑制することが報告されています 34。 次に、半脳電子顕微鏡ボリュームにおける潜在的に興奮性のセロトニン作動性背側対内側（DPM）ニューロンのγ葉神経支配の微細な解剖学的構造を研究しました。 DPM ニューロンは、MB の垂直葉、水平葉、および遠位脚を密に神経支配する別々の枝を送り、KC に対してシナプス前とシナプス後の両方にあります 35、36、37。 γ葉のDPM神経突起の超微細構造により、γ1内の2つの分岐と、γ2〜γ5コンパートメントを通過する他の腹側および背側の分岐が明らかになりました（図5a）。 γd KC上のDPMニューロンシナプスの位置は、γd KC軸索束に従い、γ1コンパートメントの腹側からγ5コンパートメントの背側までγ葉の周りに巻きつきます（図5a）。

a、DPM ニューロン γ 葉神経突起 (青緑) を伴う MB (ライト グレー) の 3D 表現 (左)。 DPM は背側 (濃いコガモ)、腹側 (明るいコガモ)、および γ1 コンパートメント (コガモ) に三分岐 (アスタリスク) します。 神経突起はストラーラー次数によって影が付けられ、ストラーラー次数が 1 未満の小枝は剪定されました。 γ1 ～ γ5 コンパートメント境界 (破線) を持つ γ ローブの詳細が表示されます (右)。 γd KC (黄色の球) への DPM シナプス前部は、γ5 の背側 DPM 枝上に共局在します。 γm KC (灰色の球) から DPM への入力シナプスは、腹側枝と背側枝全体に位置しています。 γ5では、585個のγm KCのうち450個がDPM背側枝とシナプスを形成し、98個のγd KCのうち89個もDPM入力を受け取った。 APL ニューロン入力 (マゼンタの球) は両方の DPM ブランチに沿って局在します。 b、DPM 神経突起の 2D 樹状図投影 (青緑の色合い。詳細については拡張データの図 5a を参照)。 γ1 コンパートメントはマークされており、γ2 ～ γ5 コンパートメントは背側と腹側の DPM 神経枝に分かれています。 γm KC (灰色の球) からの入力と γd KC (黄色の球) への出力は、コンパートメント固有の分岐上に共局在します。 APL ニューロン (マゼンタの球) からの抑制入力は、DPM 神経突起全体に分布します。 APL 接続の詳細については、拡張データの図 5b を参照してください。 c、d、DPM ニューロンの概略図 (c; 上)。 温度変化のタイムライン (破線) も表示されます。 6 時間の嗅覚想起パフォーマンスのトレーニング (c) またはテスト (d) 中の VT64246-GAL4;UAS-Shits1 による DPM ニューロンの出力のブロックが表示されます (下)。 e、f、DPM ニューロンの食欲多感覚 (色 + 匂い) トレーニングと匂いイメージングのタイムライン (左)。 DPM ニューロンの γ5 (e) および γ1 (f) 領域のイメージング面と、CS+ および CS- の臭気誘発活動の痕跡が示されています (中央)。 応答の定量化が表示されます (右)。 DPM の γ5 および γ1 領域は、CS+ および CS- の匂いに対して興奮性反応を示しましたが、CS+ 反応はγ5 でのみ特異的に増強されました。 g, タイムライン (左)。 MB607B-GAL4 による γd KC の 5-HT2A 受容体の RNAi ノックダウンでは、多感覚訓練後の嗅覚想起能力が損なわれましたが、5-HT2B または 5-HT7 ではありませんでした。 c、d、gでは、データは平均±semとして表され、個々のデータポイントは点として表示され、星印は有意差を示します（P < 0.05）。 Bkg、RNAi バックグラウンド。 h、食欲多感覚トレーニングと匂いイメージングのタイムライン (左上)。 γd KC軸索のγ5の撮像面（左下）。 CS+ および CS- の臭気誘発活動の痕跡 (中央)。 5HT2AR-RNAiは、多感覚訓練後のγd KCのγ5における匂い獲得によって引き起こされる興奮を排除した（図3aも参照）。 CS+ および CS- の匂いも同様に γd KC 軸索を阻害しました。 定量化も表示されます (右)。 臭気誘発活性トレースは、平均値 (実線) と標準誤差 (影) を示します。 水平の破線はベースラインのアクティビティを示します。痕跡の下の黒い実線は、5 秒間の臭気曝露を示します。 e 内のアスタリスクは、平均 CS+ 応答と CS- 応答間の有意差を示します (P < 0.05)。 各ハエの CS+ および CS- 応答は破線で結ばれています。 グループは、チューキー検定による一元配置分散分析 (c、d)、対応のある両側 t 検定 (e、f、h)、およびダネット検定による一元配置分散分析 (g) を使用して比較されました。 正確な P 値と比較は補足情報に記載されています。 Shi の場合は n = 8、他のグループの場合は n = 9 (c)。 n = 10 (d,g); n = 26 ハエ (e、f); n = 24 ハエ (h)。 コントロールについては、拡張データの図 7 を参照してください。 i、多感覚学習後の匂い特異的および色特異的KCのDPMマイクロ回路ブリッジングのモデル。

DPM神経突起の樹状図（図5b）にγ葉コンパートメント境界（DAN接続に基づく）、γm KCからのシナプス、およびγd KCへのシナプスを注釈付けると、DPMニューロンの固有の分岐がコンパートメント特異的な微小回路ブリッジを提供できることが示されました。 γm および γd KC。 DPM ニューロンは、γd KC を γm KC に架橋することもできます (拡張データ図 5a)。 大きなGABA作動性前対側方（APL）38ニューロンは、γ葉のDPM枝に沿ってシナプスを形成することが判明し（図5bおよび拡張データ図5a）、DPMブリッジングが局所阻害によって制御できることが示唆されました。 APL ニューロンは各コンパートメント内で多くの DAN 入力を受け取るため、領域特異性で制御することもできます 39 (拡張データ図 5b)。これにより、特定の DPM 分岐が APL 阻害から解放される可能性があります。

私たちは、APL ニューロンと DPM ニューロンを独立して操作することで、この推定上の微細回路ブリッジ モデルに挑戦しました。 APL ニューロンにおける DopR2 ドーパミン受容体の発現は嫌悪学習と関連しており 40、転写プロファイリングにより APL ニューロンも DopEcR 受容体を発現していることが示唆されています 41。 これらのドーパミン受容体はどちらも阻害作用があることが知られています 42,43。 したがって、我々は、多感覚学習におけるこれらの受容体の役割をテストするために、APLニューロンにおけるトランスジェニックRNAiを一時的に制限するためにtubP-GAL80ts（参考文献44）を使用した。 成人APLニューロンでDop2Rをノックダウンすると、嗅覚想起能力の多感覚増強が消失した（拡張データ図6a、c）。 嗅覚の食欲条件付け後の匂い記憶にも軽度の欠陥が観察されました。 ただし、その差は 1 つの対照に対してのみ有意でした (拡張データ図 6b、d)。 対照的に、DopEcR RNAiはどちらの実験でも効果がありませんでした（拡張データ図6e、f）。 これらの結果は、ドーパミン阻害APLニューロンが強化されて、多感覚学習中にγd KCが嗅覚記憶エングラムに動員されることを可能にすることと一致している。

私たちは、UAS-Shits1 の発現を使用して、セロトニン作動性 DPM ニューロンの役割をテストしました。 取得中（図5cおよび拡張データ図7a）または検索中（図5dおよび拡張データ図7a）のいずれかでDPMニューロンからの伝達を一時的に制限すると、匂い想起記憶の多感覚訓練強化が著しく損なわれました。 DPM ニューロン出力をブロックすると、多感覚学習後の視覚記憶の想起も損なわれました (拡張データ図 7b)。 以前の研究と同様に、これらの同じ操作は、単感覚嗅覚学習後の匂い記憶に影響を与えませんでした（拡張データ図7c）。 これらのデータは、学習中に同時に活性化した KC ストリームを結合するために DPM ニューロンの出力が必要であることと一致しますが、記憶想起中の DPM ニューロンの出力は、匂いによって駆動される γm KC が関連する γd KC を活性化するための接続を提供します。

次に、多感覚学習が嗅覚γm KCと視覚γd KCの間に興奮性DPMニューロン微小回路架橋を確立するというモデルを直接テストするために、行動実験と生理学的実験を実施しました。 まず、UAS-Shits1を使用して、多感覚トレーニング後の嗅覚および視覚記憶想起の強化のためにトレーニング中にγ-KC（γmおよびγd）出力が必要かどうかを判断しました。 多感覚学習中にγ-KCをブロックすると、嗅覚と視覚の両方の想起が著しく損なわれましたが（拡張データ図7e-h）、以前の研究のように、嗅覚学習は変化しませんでした（拡張データ図7d）。 多感覚記憶のネットワーク可塑性には KC 出力が必要であるという発見は、単感覚嗅覚記憶とは異なる学習規則が関与していることを示唆しています 16,49。

UAS-ASAP2fを使用して、多感覚報酬学習後のDPMニューロンの機能的接続のコンパートメント特異的な可塑性を検索しました。 嗅覚報酬学習は、CS + 臭気に対する DPM ニューロンのカルシウム応答を最大 2.5 時間特異的に増加させることが示されました（参考文献 36、50）（1 時間の電圧記録を参照、拡張データ図 7k-l）。 多感覚トレーニングの6時間後に記録すると、γ1コンパートメントではなくγ5コンパートメントのDPM投影におけるCS +臭気電圧反応の明確かつ特異的な増加が明らかになりました（図5e、f）。嗅覚学習後のこの時点では存在しませんでした（拡張データ）図7i、j)。 これは、多感覚報酬学習が、MB の γ5 コンパートメントの微小回路内の CS+ 匂い特異的 γm KC から DPM ニューロンへのシナプスを強化することを示唆しています。 γd KCの以前のイメージングでは、それらも多感覚報酬学習後にγ5セグメントで活性化されるCS +匂いになることが示されたため（図3a）、γd匂い反応の獲得がDPMニューロン放出セロトニンによって媒介されるかどうかをテストしました（5） -ヒドロキシトリプタミン(5-HT))。 我々は最初に、5-HTの浴適用（他のニューロンを介した間接的な活性化をブロックするテトロド​​キシンの存在下）が、ナイーブハエにおいてUAS-ASAP2fを発現するγd KCの脱分極を直接誘発することを確立した（拡張データ図7o、p）。 5-HT は、5-HT2A タイプおよび 5-HT7 タイプの受容体を介して興奮効果を発揮します 51。 したがって、RNAiを使用してγd KCのこれらの受容体をノックダウンしました。 5-HT7 または 5-HT2B ではなく、5-HT2A 受容体の発現を低下させると、多感覚トレーニング後の嗅覚記憶能力が低下しましたが (図 5g)、嗅覚トレーニングでは低下しませんでした (拡張データ図 7q)。 さらに、γd KCで5-HT2A RNAiをUAS-ASAP2fと共発現させると、γd KCのγ5領域における多感覚学習誘発のCS+匂い活性化が廃止されましたが（図5h）、色誘発には影響しませんでした。応答 (拡張データ図 7r)。 これらの解剖学的、遺伝的、生理学的データを総合すると、強化子によって誘発されたコンパートメント特異的ドーパミンがAPL媒介阻害を解除し、同じ強化ドーパミンが興奮性セロトニン作動性匂いと色を形成するKC-DPMおよびDPM-KC可塑性を誘導するのを促進すると結論付けることができます。特異的なDPMマイクロ回路は、関連するγmとγdのKC間を橋渡しし（図5i）、おそらくその逆も同様です。

私たちの研究は、多感覚学習によって、たとえ個々の感覚刺激であってもその後の記憶能力が向上するショウジョウバエの正確な神経機構を説明しています。 視覚的な手がかりを用いた単一のトレーニング試行では、トレーニング中に匂いと組み合わせた場合にのみ強力な記憶能力を生成できます。これは、付随する聴覚情報を必要とする人間の視覚的なリズム知覚学習と同様です。 我々は、多感覚学習が、セロトニン作動性 DPM ニューロンを介して、MB γ-KC の軸索内の時間的に偶発的な匂いと色からの情報を結合することを示しました。その活動は、同時発生時間ウィンドウも定義します 53。 この学習駆動型の結合により、視覚的に（おそらく色）選択的なKCの軸索が変換され、時間的に偶発的に訓練された匂いにも反応するようになります。 また、嗅覚選択的KCの軸索が、時間的に偶発的に訓練された色によって活性化されることも実証しました。 主な樹状突起入力は、γm KCを嗅覚、γdを視覚と定義しますが、我々の記録では、それらの軸索のセグメントが多感覚学習後に多峰性になることが示されました。 この結果は、γ-KC が他の時間的に偶発的な感覚情報を明示的な感覚手がかりの情報と統合できる基質である可能性が高いことを示唆しています 54,55。

私たちの実験は主に、匂いによって活性化されるγm KCがDPMマイクロ回路を介して色γd KCをリクルートすることに焦点を当てていたが、観察された多感覚学習後の視覚記憶の行動的強化、γm KCが訓練された色に反応するようになるという実証、およびDPMニューロンの相互接続性が示唆されている。 DPM ニューロンもおそらく逆極性ブリッジを仲介していると考えられます。 その際、多感覚学習では、DPM ニューロンを使用して、時間的に偶発的な各感覚刺激に反応する KC をリンクし、各刺激の表現を他の刺激の表現に拡張します。 このクロスモーダルな拡張により、複数の感覚の経験を、組み合わせられた合図やそれぞれの合図によって効率的に取得できるようになります。 その結果、訓練されたハエは、学習した匂いによる視覚体験の記憶と、学習した色による匂いの記憶を呼び起こすことができます。 これらの発見は、ハエが哺乳類における海馬依存のパターン補完と概念的に同等の機能を達成する神経機構を提供し、部分的なシーンからより完全な記憶表現を検索できる56。 統合失調症や自閉症のヒト患者は多感覚統合の欠陥を示しており 57、これらの状態はセロトニン作動性機能不全と 5-HT2A 受容体に関連付けられています 58。 ここでの私たちの研究は、多感覚知覚の不適切なルーティングがこれらの状態に寄与している可能性があることを示唆しています。 さらに、多感覚結合を媒介する興奮性 5-HT2A 受容体は、幻覚剤の主要な標的です 59。

すべてのキイロショウジョウバエ株は、特に記載のない限り、標準的なコーンミール寒天飼料（100 g l-1 無水 d-グルコース、47.27 g l-1 有機トウモロコシ粉、25 g l-1 自己消化物）上で 25 °C、湿度 40 ～ 50% で飼育しました。酵母、7.18 g l−1 寒天および 12.18 g Tegosept を 8.36 ml の無水エタノールに溶解（ハエの餌 1 リットルあたり）、12:12 時間の明暗サイクルで。 Canton-S ハエは野生型 (WT) として使用され、William Quinn の研究室 (マサチューセッツ工科大学、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国) に由来しました。 次の GAL4 系統が行動実験で使用されました: MB607B-GAL4 (参考文献 13、60)、MB009B-GAL4 (参考文献 13、60)、c708a-GAL4 (参考文献 61)、VT43924-GAL4.2 (参考文献 13、60)。 39) および VT64246-GAL4 (参照 62)。 神経出力の温度制御による遮断は、MB607B-GAL4 (参考文献 13、60)、MB009B-GAL4 (参考文献 13、60)、c708a- の制御下で UAS-Shits1 (参考文献 21) 導入遺伝子を発現させることによって達成されました。 GAL4 (参照 61) および VT64246-GAL4 (参照 62) ドライバー。 APLを含むRNAiノックダウン実験では、tubP-GAL80ts（参考文献44）、VT43924-GAL4.2（参考文献39）のハエをUAS-Dop2R RNAi63およびUAS-DopEcR RNAi（VDRC ID: 103494）のハエと交雑させた。 同じドライバー系統を、対照として WT ハエおよび RNAi バックグラウンド株 (VDRC ID: 60100) と交配しました。 γd KC を含む RNAi ノックダウン実験では、MB607B-GAL4 (参考文献 13、60) ハエを UAS-5-HT2A RNAi (31882、BDSC)、UAS-5-HT2B RNAi (60488、BDSC) および UAS-5- HT7 RNAi (27273、BDSC) が飛びます。 同じドライバー系統を、コントロールとして RNAi バックグラウンド株 (36304、BDSC) と交配しました。 ライブイメージング実験では、MB607B-GAL4 (参考文献 13、60) および VT64246-GAL4 (参考文献 62) を使用して UAS-ASAP2f64 を発現させ、1471-GAL4 (参考文献 66) ドライバーラインを備えた UAS-ASAP2s65 を発現させました。 行動実験と画像実験には雄と雌の両方のハエを使用しました。

UAS-Shits1 雄と c708a-GAL4 処女雌を交配した c708a-GAL4 を含む実験を除き、GAL4 系統の雄ハエを UAS-Shits1 処女雌と交雑させた。 ヘテロ接合性対照として、GAL4 または UAS-Shits1 ハエを WT ハエと交雑させました。 RNAi 実験では、GAL4 または RNAi ハエを、それぞれ適切な RNAi バックグラウンド株または WT ハエと交配しました。 RNAi 発現の操作について以下に記載する場合を除き、すべてのハエを 25 °C で飼育しました。 すべての実験では、生後 2 ～ 8 日のハエの集団が使用されました。

食欲条件付け実験では、80 ～ 100 匹のハエを、1% 寒天 (水源として) と 20 × 60 mm の濾紙を入れた 25 ml バイアルに入れ、訓練前に 19 ～ 22 時間放置し、一定期間絶食させました。 24 時間記憶を分析する場合を除き、実験全体。ハエは訓練後 30 分間餌を与え、その後試験まで飢餓バイアルに戻されました。 嫌悪条件付け実験では、行動実験の前に、80 ～ 100 匹のハエを、標準的な餌と濾紙の入ったバイアルに 14 ～ 22 時間入れました。

UAS-Shits1 によるニューロン遮断を伴う実験について、温度変化のタイムラインの概略図を各図に示します。 Shits1 実験では、ハエをトレーニングおよび/またはテストの前に 30 分間、制限された 33 °C に移しました。 tubP-GAL80ts;VT43924-GAL4.2 を含む RNAi 実験では、ハエを 18 °C で飼育し、羽化後に 29 °C に移して、行動実験の 3 日間 RNAi 発現を誘導しました。 実験中、ハエは 29 °C に保たれました。

すべての行動実験は、色と匂いの刺激を同時に送達できるように改良された標準的な T 字迷路を使用して実施されました。 半透明のプラスチックで作られた T 迷路は、視覚刺激を並行して使用した場合の視覚刺激間の干渉を最小限に抑えるために、不透明な遮光フィルムで覆われています。 臭気は、鉱油で希釈された MCH および OCT でした (約 1:10-3 の希釈率)。 色は発光ダイオード (LED) によって提供されました。 波長 530 ± 10 nm の緑色 LED (PM2E-3LGE-SD、ProLight Opto) と波長 465 ± 10 nm の青色 LED (PM2B-3LDE-SD、ProLight Opto)。 4 つの LED がヒートシンク上に構築された回路に組み立てられ、臭気送達チューブの上部にしっかりと取り付けられました。 LED の強度は、ナイーブなハエが照明された T 迷路アーム間で走光性の優先性を示さないように調整されました。 視覚刺激は、トレーニングとテストの両方で同じ方法および同じ強度で提示されました。 食欲をそそる実験のために、試験管には濾紙が敷かれました。 嫌悪感のある実験のために、試験管には非帯電ショックグリッドが並べられていました。 実験は、希望の温度と相対湿度 55 ～ 65% に設定された環境チャンバー内で実行されました。 ハエは、頭上の赤色光の下でトレーニングおよびテストする前に処理されました。

食欲的条件付けは、基本的に前述したとおりに実行されました67。 簡単に説明すると、ハエを乾燥濾紙 (CS-) を入れたチューブ内で補強なしで刺激 Y (YColour および/または YOdour) に 2 分間曝露し、清浄な空気に 30 秒間曝露し、その後刺激 X (XColour および/または YOdour) で 2 分間曝露しました。 XOdour)を濾紙上で乾燥させた5.8Mスクロースを加えた(CS+)。 嫌悪性嗅覚条件付け 17,18 では、ハエに刺激 X (XColor および/または XOdour) への 1 分間の曝露と、5 秒間隔で 12 回の 90 V 電気ショック (CS+)、45 秒間のきれいな空気、その後 1 分間の曝露を受けさせました。強化なしの刺激 Y (YColour および/または YOdour) への最小曝露 (CS-)。 電気ショックは、Grass S48 Square Pulse Stimulator (Grass Technology) を使用して与えられました。 ショック グリッドは前述したものであり 68、透明なマイラー フィルムに印刷された銅の列が交互に配置されて構成されており、色付きの光を通過させることができます。

記憶能力は、CS- と CS+ の色および/または匂いの間の好みについてハエを 2 分間テストすることによって評価されました。 臭気テストは暗闇の中で行われました。 各アームのハエを収集し、ポリスチレンチューブ(キャップ付き14ml丸底ポリプロピレン試験管、Falcon)に移した。 ハエの入ったチューブを -20 °C で凍結し、ハエを取り出して手動で数えました。

性能指数は、CS+ アームのハエの数から CS- アームのハエの数を引いて、ハエの総数で割ったものとして計算されました。 すべての行動実験において、単一のサンプル、つまり n は、CS+ と CS- の相互の色と匂いの組み合わせで訓練された 2 つの独立したハエのグループからの平均パフォーマンス指数を表します。 各実験の合計 n は、異なる日に 3 つの異なるトレーニング セッションで取得されました。

6 つの行動プロトコルが使用されました。

視覚学習: 色 (XColour および YColour) を CS+ および CS- として使用しました。

嗅覚学習: 匂い (XOdour および YOdour) を CS+ および CS- として使用しました。

一致したプロトコル: 色と匂いを CS+ および CS- として組み合わせました (XColour + XOdour および YColour + YOdour)。 トレーニングとテストでは、同じ色と匂いの組み合わせが使用されました。

不一致なプロトコル: 色と匂いの刺激の偶発性をトレーニング (XColour + YOdour および YColour + XOdour) とテスト (XColour + XOdour および YColour + YOdour) の間で切り替えました。

視覚および嗅覚の学習プロトコルは単感覚的ですが、一致するプロトコルと不一致なプロトコルは多感覚的です。

嗅覚検索: ハエは一致するプロトコルに従って訓練されましたが、テストでは匂い (XOdour と YOdour) のみが選択肢として提示されました。

視覚的検索: ハエは一致プロトコルのように訓練されましたが、テストでは色 (XColour と YColour) のみが選択肢として提示されました。

図4f、gに示す一連の学習実験では、嫌悪性または食欲性の一致する多感覚トレーニングに続いて、単感覚の食欲性または嫌悪性の嗅覚学習を使用し、次に嗅覚検索を使用したテストを使用しました。

すべてのハエは 25 °C で飼育され、すべての実験には生後 3 ～ 8 日の雄および雌のハエが使用されました。 イメージング実験は、基本的に前述のように実行されました69、70、71。 簡単に言うと、嗅覚学習 (プロトコル 2)、一致する多感覚プ​​ロトコル (プロトコル 3)、またはペアのないトレーニング プロトコルのいずれかを使用して、ハエを T 迷路セットアップで訓練しました。 ペアのないトレーニングでは、ハエは匂いと視覚の組み合わせ刺激（XColour + XOdour および YColour + YOdour の組み合わせ）に曝露されましたが、ショックまたは砂糖はそれぞれ CS+ の 2 分前または 2 分後に単独で与えられました。 訓練後、記録するまでハエを暗闇に保管した。 記録の直前に、ハエを氷上で一時的に固定し、触角と脚を自由に動かせる特注のチャンバーに取り付けました。 室温の炭酸ガス（95% O2 および 5% CO2）緩衝液の下で頭部カプセルを開け、記録チャンバー内のハエを 2 光子顕微鏡 (Scientifica) の下に置きました。 飢えたハエの場合、次の無糖緩衝液を使用しました: 108 mM NaCl、5 mM KCl、5 mM HEPES、15 mM リボース、4 mM NaHCO3、1 mM NaH2PO4、2 mM CaCl2 および 8.2 mM MgCl2、浸透圧 272 mOsm、pH 7.3)。 給餌されたハエの場合、次のバッファーを使用しました: 103 mM NaCl、3 mM KCl、5 mM N-Tris、10 mM トレハロース、10 mM グルコース、7 mM スクロース、26 mM NaHCO3、1 mM NaH2PO4、1.5 mM CaCl2 および 4 mM MgCl2 、浸透圧２７５ｍＯｓｍ、ｐＨ７．３）。

ハエは、鉱油溶媒からの蒸気（空気）を運ぶ一定の空気流にさらされました。 匂い誘発イメージング実験では、行動試験をシミュレートするために、ハエを CS+ および CS- の匂いにそれぞれ 5 秒間、間に 30 秒間連続して曝露しました。 行動実験と同様に、臭気は MCH と OCT (ミネラルオイルで約 1:10-3 に希釈) であり、それらを相互に CS+ と CS- として使用しました。 提示された 2 つの匂いのうちの 1 つに反応しなかったハエは、さらなる分析から除外されました。 色誘発イメージング実験では、色の表現が画像取得とインターリーブされました。 これは、対物レンズ上のシャッター(コントローラ付きØ1/2インチステンレス鋼絞り光学ビームシャッター、当社)と外部制御の2番目のシャッター(Vincent/UniBlitz VS35S2ZM1R1-21 Uni-Stable Shutter、UniBlitz VMM-T1 Shutter Driver/)を使用して実現されました。 LED 送達システム上のタイマー コントローラー) 記録の各サイクルで、色は 0.4 Hz で 0.75 秒間提示され、続いて 1.75 秒間画像取得が行われました。重要なことに、0.4 Hz のパルス色提示は、ナイーブ ハエの γd KC で強力な応答を引き起こしました。 、UAS-ASAP2fで測定され（拡張データ図4h）、0.4 Hzのちらつき色による行動記憶テストでは、連続色表示で生成されたものと同様の記憶性能が得られました（拡張データ図4d、e）。 ASAP2f よりも遅くて大きな応答が生成されるため、γm KC 記録の場合は、色表現とインターリーブされた画像取得に有益であると考えられ、ハエを CS+ カラーに 4 回、次に CS- カラーに 4 回連続して曝露しました。各色のプレゼンテーションとそれに続く画像取得サイクル。 CS+ と CS- の記録は 30 秒の間隔で分離されました。 青と緑を CS+ と CS- として相互に使用しました。 脳の 1 つの半球をランダムに選択して、KC 軸索を画像化しました。 γ1 と γ5 は異なる平面に存在することがほとんどであるため、γ ローブのすべての MB コンパートメントにわたって画像化することはほとんど可能ではありません。 したがって、これら 2 つのコンパートメントを個別に分析する必要がありました。

蛍光は、Ti-Sapphire レーザー (Chameleon Ultra II、Coherent) によって生成された 910 nm を中心とする、約 140 fs パルス、80 MHz 繰り返し率を使用して励起されました。 256 × 256 ピクセルの画像は、ScanImage 3.8 ソフトウェア72 によって制御され、5.92 Hz で取得されました。 臭気は、LabView (v.11) によって制御されるカスタム設計のシステム 73 を使用して配信されました。

急性 5-HT の適用では、灌流ポンプ システム (14-284-201、Fisher Scientific) を使用して、約 0.043 ml s-1 の速度で生理食塩水を連続的に送達しました。 1 μM テトロドトキシンの存在下で 5-HT を適用して、電位依存性ナトリウム チャネルと間接的な興奮を引き起こす可能性のある活動電位の伝播をブロックしました。 γd KC 膜電圧に対するセロトニンの影響を調べるために、ベースライン蛍光を 5 分間記録した後、100 μM セロトニン塩酸塩 (H9523、Sigma Aldrich) を含む溶液に切り替えてさらに 5 分間記録しました。 溶液を生理食塩水に戻すことによってウォッシュアウトを行った。 使用される 5-HT の適用時間と濃度は、ショウジョウバエの脳に外因性 5-HT を適用する最近の生理学的研究に匹敵します 74,75,76,77。 灌流チューブの長さとデッドボリュームにより、灌流スイッチが脳に到達するまでに約 70 秒かかりました。

分析のために、画像安定化プラグイン 79 を含むカスタム コードを使用して、Fiji78 を使用して 2 光子蛍光画像を手動でセグメント化しました。 動物の動きは、画像に登録する必要がないほど十分に小さかった。 その後の定量分析には、カスタム Fiji および MATLAB スクリプトが使用されました。 各刺激応答のベースライン蛍光 F0 は、匂いまたは色の提示の 2 秒前からその時点まで (または 5-HT 治療の場合は記録開始後 30 秒) の平均蛍光 F として定義されました。 したがって、-ΔF/F0 は、このベースラインに対する蛍光を表します。 KC の臭気誘発反応については、5 秒間の臭気刺激中の -ΔF/F0 の積分として曲線下の面積を測定しました。 応答の形状に関する推論を行わないため、積分された曲線下の面積 (つまり、(−ΔF/F0) × (5 秒)) を報告するときに実験の自然単位を維持することを選択しました。 色誘発性 KC 応答については、最初の取得サイクル (1.75 秒) の平均蛍光シグナル (-ΔF/F0) を定量化しました。 各 n は、異なる個々のハエからの記録に対応します。 すべてのデータは、異なる日に 3 つの異なるトレーニング セッションを通じて取得されました。

5-HT 治療の場合、「前治療」を 5-HT 送達前の 300 秒間の平均 -ΔF/F0 値として定義し、5-HT 適用は 5-HT 投与中の 300 秒間の平均 -ΔF/F0 値でした。 HT送達および薬物送達のオフセットからの300秒間の平均-ΔF/F0としての「ウォッシュアウト」治療。 トレースは、移動平均フィルターによって 5 秒にわたって平滑化されました。 各 n は、異なる個々のハエからの記録に対応します。 すべてのデータは、異なる日に 3 つの異なるイメージング セッションにわたって取得されました。

ASAP2f および ASAP2s のデータは、センサーの蛍光と膜電圧の間の逆関係を補正するために、-ΔF/F0 として表示されます。

統計分析は GraphPad Prism で実行されました。 すべての行動データは、対応のない両側 t 検定、マン - ホイットニー U 検定、一元配置分散分析、またはクラスカル - ウォリス H 検定、その後の事後テューキー、ダネット、またはダンの多重比較検定で分析されました。 サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 サンプルサイズは、この分野の他の出版物と同様でした。 画像実験では、正規分布データの一対両側 t 検定と反復測定一元配置分散分析によって匂い誘発反応を比較し、非ガウス分布データにはウィルコクソン符号付き順位検定を使用しました。 正規性は、D'Agostino および Pearson の正規性検定を使用して検定されました。 画像データについては、誤検出率に基づいて外れ値を特定する方法 (ROUT 方法) がデータセットごとに実行されました。 誤検出率は可能な限り最高の Q 値 (10%) に設定されました。 潜在的な外れ値が特定されたデータセットでは、それらのハエの匂いによって引き起こされる反応をすべて除去することによって統計分析が実行されました。 外れ値の有無にかかわらず分析に違いはなかったので、潜在的な外れ値が含まれる可能性がある完全なデータセットを維持して提示することにしました。 部分η二乗を使用して効果の大きさを報告しました（η2 = 0.01は小さな効果を示し、η2 = 0.06は中程度の効果を示し、η2 = 0.14は大きな効果を示します）。 使用された式は統計表に報告されます。 すべての統計分析は、補足情報の統計表にも報告されます。

実験は、それぞれの独立した実験に存在する適切な対照を用いてランダム化されました。 テストおよび分析されたすべての遺伝子型は、実験者に対して自己盲検化されました。 研究デザインの詳細については、レポート概要をご覧ください。

Python 3.8.8 の NAVis 1.2.1 ライブラリ関数に基づくスクリプトを使用して、神経形態学的計算と接続性分析が実行され、樹状図が計算およびプロットされました (https://pypi.org/project/navis/; https://github. com/navis-org/navis)80 およびショウジョウバエの半脳からのデータ (v.1.2.1) (https://neuprint.janelia.org)32,33。 すべてのニューロン骨格が修復され (navis.heal_skeleton (method = "ALL"、max_dist = "100 nanometer"、min_size = 10))、再ルートされ (navis.reroot_skeleton (x.soma))、保存されたコネクターで強力にダウンサンプリングされました (navis. downsample_neuron(downsampling_factor = 1000、preserve_nodes = 'connectors'))。

Strahler 次数が 1 以下の小枝を剪定した後 (navis.prune_by_strahler())、Strahler 次数によってシェーディングされたニューロンの 3D 表現が navis.plot2d (method='3d', shade_by='strahler_index') で生成されました。 該当する場合、特定のボリューム内のブランチのみが考慮されました (navis.in_volume())。 ボリュームは、fetch_roi() を使用して neuprint (v.1.2.1) から取得されました。 接続性は、枝刈りされていないニューロンを使用し、コンパートメント特異性 (navis.in_volume()) を使用して分析されました。

navis.plot_ flat() に基づくカスタム スクリプトを使用して、Strahler 次数 1 以下の小枝を剪定した DPM および APL ニューロンの樹状図を生成しました。 MB コンパートメントの境界は、それぞれのコンパートメントの DAN への接続によって定義されました。 γ ローブの外側の枝は、γ ローブ コンパートメントの視認性を高めるために手動で縮小されました。 シナプスは in_volume() によってフィルタリングされ、Strahler 次数が 1 を超えるブランチに表示されます。接続統計は枝刈りされていないニューロンに基づいており、ニューロン間のシナプスは R ベースの natverse:: neuprint_get_synapses() (https://natverse.org) で取得されました。 )80 個のスクリプトがあり、Python のカスタム スクリプトで処理されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究結果を裏付けるデータは、https://github.com/PJZO/Multisensory-learning-Engram.git で入手できます。 「方法」の「神経解剖学、接続性、および樹状図」セクションで言及されているショウジョウバエの半脳のデータセットは、https://neuprint.janelia.org で公開されています。

カスタマイズされた MATLAB および Fiji/ImageJ スクリプトは、https://github.com/PJZO/Multisensory-learning-Engram.git で入手できます。 メソッドの「神経解剖学、接続性、樹状図」セクションで説明されているコードは、https://pypi.org/project/navis/、https://github.com/navis-org/navis、および https:/ で公開されています。 /natverse.org.

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リファレンスをダウンロードする

R. Brain、K. delos Santos、R. Busby、M. Moreno Gasulla、J.-P. に感謝します。 Moszynski と F. Woods が技術支援をしてくれました。 G. Rubin、FlyLight、B. Dickson、A. Lin、ウィーン ショウジョウバエ リソース センター、およびハエのブルーミントン ストック センター。 ZO は、EMBO の長期ポスドクフェローシップ (ALTF 311-2017) によって資金提供されました。 PV-G. 資金は、同大学のクラレンドン基金制度とキーブル大学、および国立科学技術研究所 (CONACYT) から与えられたスローン・ロビンソン/クラレンドン奨学金によって賄われました。 SW は、Wellcome Principal Research Fellowship (200846)、Wellcome Discovery Award (225192)、ERC Advanced Grant (789274)、および Wellcome Collaborative Awards (203261 および 209235) によって資金提供されました。

ニルス・オットー

現在の住所: 解剖学・分子神経生物学研究所、ミュンスター大学、ミュンスター、ドイツ

これらの著者は同様に貢献しました: Zeynep Okray、Pedro F. Jacob

オックスフォード大学、神経回路および行動センター、オックスフォード、英国

ゼイネプ・オクレイ、ピーター・F・ジェイコブ、シアラ・スターン、キーラン・デズモンド、ニルス・オットー、クリフォード・B・タルボット、パオラ・バルガス＝グティエレス、スコット・ワデル

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ZO、PFJ、CBT、SW が調査を設計しました。 ZO、PFJ、CS、KD、NO、PV-G。 実験を行った。 ZO、PFJ、CS、KD、NO がデータを分析しました。 SW がリソースを提供しました。 SW、ZO、PFJ、NOが原稿を書きました。 SWが研究を監督した。 SWとZOが資金を獲得した。

ゼイネプ・オクレイまたはスコット・ワデルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

ａ． 左上、多感覚プロトコル。 緑と青の四角は色を表し、明るい灰色と濃い灰色の四角はOCTとMCHの匂いを表します。 視覚 (V) 学習: CS+ および CS- として使用される色。 嗅覚 (O) 学習: CS+ および CS- として使用される匂い。 一致 (C) プロトコル: 色 + 臭気を CS+ および CS- として組み合わせました。 トレーニングとテスト中に使用されたものと同じ色と匂いの組み合わせ。 不一致 (I) プロトコル: 色 + 匂いは CS+ および CS- として組み合わせられましたが、組み合わせはトレーニングとテストの間で切り替えられました。 左下、トレーニングとテストのタイムライン。 そうです、V、O、C、I プロトコルの 24 時間のメモリ パフォーマンス。 一致（C）プロトコルで色と匂いを組み合わせると、単感覚の V または O 学習で得られたものと比較して、24 時間のパフォーマンスが向上しました。 色と匂いの不一致（I）ペアリングにより、24 時間記憶の多感覚強化が無効になりました。 b. 左はトレーニングとテストのタイムライン。 中間の多感覚プロトコル。 そう、即時記憶のパフォーマンスです。 ハエは、I プロトコルよりも C プロトコルの後の方が有意に高い記憶力を示しました。 c. 左はトレーニングとテストのタイムライン。 中間、多感覚プロトコル: 前述の C プロトコル。 トレーニングおよびテスト中に、CS+ および CS- として異なる匂いと組み合わせた同じ色 (C-sc) を使用する一致したプロトコル。 右側、CS+ と CS- で異なる色と匂いの組み合わせを使用した C プロトコルは、両方の匂いで同じ色を使用した C-sc プロトコルよりも高い即時記憶能力をもたらしました。 d. 左はトレーニングとテストのタイムライン。 中位、多感覚プロトコル: 前述の嗅覚 (O) 学習。 多感覚検索 (MSR): トレーニング中の匂いは CS+ と CS- であり、テスト中はこれらの同じ匂いが異なる色と組み合わされました。 そうです、MSR によって引き起こされる即時記憶のパフォーマンスは、嗅覚による学習と想起の場合と比べて大幅に低下しませんでした。 e. 左はトレーニングとテストのタイムライン。 中間、多感覚プロトコル: 上記の適合 (C) プロトコル。 匂い検索 (OR): トレーニング中は色 + 匂いが CS+ および CS- であり、テスト中は匂いのみが使用されました。 そうです、多感覚刺激で訓練されたハエは、単一のモダリティ (この場合は匂い) のみと比較して、一致する多感覚刺激でテストされた場合に、より良い成績を収めました。 アスタリスクは有意差を示します (P < 0.05)。 データは平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。 ドットとして表示された個々のデータ ポイントは、独立した実験に対応します。 グループは、一元配置分散分析とテューキー検定 (a)、対応のない両側 t 検定 (b、c、e)、および対応のない両側マンホイットニー U 検定 (d) を使用して比較し、正確な P 値と比較が示されています。補足情報に記載されています。 各実験の N 値は次のとおりです: a、b、e、n = 10。 c、n = 8; d、OR の場合は n = 10、MSR の場合は n = 8。

ａ． 左上、γd KC の概略図。 左下、一定の制限温度を使用したトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 そうです、MB607B-GAL4 を使用した実験によって γd KC がブロックされた場合、嗅覚学習後の 6 時間の記憶性能は変化しません。 UAS-Shits1 b および c。 実験全体を通してγd KCをブロックすると、Congruentプロトコルでの記憶が著しく損なわれました（b）。 不一致プロトコルの干渉効果からの解放は有意に達しませんでした (c)。 d. 左上、αβp KC の概略図。 左下、一定の制限温度を使用したトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 右、c708a-GAL4 を使用して実験全体を通じて αβp KC 出力をブロック。 UAS-Shits1 は 6 時間の嗅覚学習を阻害しませんでした。 eとf。 実験中にαβp KCがブロックされた場合、一致(e)および不一致(f)プロトコルの記憶性能は大幅に変化しました。 gとh。 上、温度変化を伴うトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 γd (g) および αβp (h) KC をブロックすると、視覚的手がかりで回復される記憶が損なわれます。 私。 左上、γd KC の概略図。 右上、一定の許容温度でのトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 il MB607B-GAL4 のメモリ性能。 一致（i）、不一致（j）、嗅覚検索（k）および視覚検索（l）プロトコルに従ったUAS-Shits1ハエは、トレーニングとテストが23°Cで実行された場合には影響を受けませんでした。 メートル。 左上、αβp KC の概略図。 左下、一定の許容温度でのトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 mo c708a-GAL4 のメモリ パフォーマンス。 トレーニングとテストが 23 °C で行われた場合、一致 (m)、不一致 (n)、および視覚的検索 (o) プロトコル後の UAS-Shits1 フライは影響を受けませんでした。 アスタリスクは有意差を示します (P < 0.05)。 データは平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。 ドットとして表示された個々のデータ ポイントは、独立した実験に対応します。 グループは、一元配置分散分析とテューキー検定 (ag、io)、およびクラスカル・ウォリス H 検定とダン検定 (h) を使用して比較し、正確な P 値と比較を補足情報に示します。 各実験の N 値は次のとおりです: a-c、g、h、n = 12。 c708a の場合は d, n = 12、他のすべてのグループの場合は n = 10、f, n = 10。 io、n = 8。

aとb。 左上、ペアのない食欲トレーニングと匂いイメージングプロトコル。 色と匂いの表現は砂糖に依存しませんでした。 左下、γd KC の γ5 領域 (a) および γ1 (b) の撮像面。 中央、CS+ および CS- の臭気誘発活性の痕跡。 γd KC のどちらの領域でも、対になっていない多感覚の食欲訓練は匂い反応を変化させません。 そうです、匂いによって引き起こされる反応の定量化です。 c. ナイーブハエにおけるγd KCのγ5領域における色誘発反応（青、緑、およびコントロール、つまりLEDオフ）。 カラー表示中は画像取得がシャットダウンされます。 右、定量化により、青色、緑色の光および制御 (LED オフ) に対する興奮性反応が示されます。 dとe。 色光のパルス配信は、多感覚学習後の一致プロトコル (d) または視覚検索 (e) に​​おける多感覚記憶のパフォーマンスに影響を与えません。 アスタリスクは有意差を示します (P < 0.05)。 データは平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。 ドットとして表示された個々のデータ ポイントは、独立した実験に対応します。 fとg。 左上、食欲多感覚（色+匂い、f）および単感覚（匂い、g）のトレーニングと匂いイメージングのタイムライン。 左下、γd KC 体細胞の撮像面。 中央、CS+ および CS- の臭気誘発活性の痕跡。 CS+ および CS- 臭気に対する抑制反応 (-ΔF/F0 の減少) は、どちらのパラダイムでも明らかでした。 そう、定量化です。 hと私。 左上、食欲多感覚（色+匂い）トレーニングと匂いイメージングのタイムライン。 左下、γm KC の γ5 (h) および γ1 (i) 領域の撮像面。 中央、CS+ および CS- の臭気誘発活性の痕跡。 γm KC の γ1 領域と γ5 領域は両方とも、CS+ および CS- 臭気に対する興奮を示します (-ΔF/F0 の増加)。 そう、定量化です。 すべての痕跡と定量化について、CS+ と CS- の提示には、他のすべての実験と同様に、匂いが 50:50 で交互に繰り返されました。 匂いまたは色によって誘発される活性追跡は、SEM (影) で平均 (実線) を示します。 水平の破線はベースラインのアクティビティを示します。 痕跡の下の黒い線は、5 秒間の臭気曝露を示します。 (c) では、灰色の垂直バーは 0.75 秒のカラー表示 (画像取得がシャッタリングされたとき) に対応し、ボックスは定量化の期間 (1.75 秒) に対応します。 アスタリスクは、平均した CS+ 応答と CS- 応答間の有意差を示します (P < 0.05)。 個々のハエの CS+ および CS- 応答は破線で結ばれています。 対応のある両側 t 検定 (a、b、fi)、1 サンプル t 検定 (c)、テューキー検定を使用した一元配置分散分析 (d)、および対応のない両側 t 検定 (e) を使用してグループを比較しました。 、正確な P 値と比較は補足情報に記載されています。 各実験の N 値は次のとおりです。 a、b、n = 20 ハエ。 c、n = 緑の場合は 20 匹のハエ、青の場合は n = 20 匹のハエ、LED オフの場合は n = 6。 d、e、n = 8; f、g、n = 22 ハエ。 h、i、n = 16 匹のハエ。

ａ． 最も嫌悪的なトレーニングとテストのタイムライン。 下は多感覚の実験条件。 緑と青の四角は色を表し、明るい灰色と濃い灰色は OCT と MCH の匂いを表します。 視覚（V）学習。 嗅覚（O）学習。 一致(C)プロトコル。 不一致 (I) プロトコル。 嗅覚回復 (OR); 視覚的検索 (VR)。 BD。 上部、トレーニングとテストのタイムライン。 下、C プロトコルでの嫌悪記憶は、トレーニング直後 (b) と 3 時間 (c) の両方で I プロトコルの場合よりも大幅に増加しました。 C プロトコルのハエは、嗅覚 (O) 学習の 3 時間後にテストされたハエを上回りました。 C プロトコルのみが 24 時間の顕著なメモリ パフォーマンスを生成しました (d)。 eとf。 上部、トレーニングとテストのタイムライン。 下は、すぐにテストした場合（e）、色で取得した多感覚記憶（VR）は、単感覚視覚学習後の記憶（V）よりも著しく優れていました。 3時間（f）の時点で、多感覚訓練されたハエは、単感覚嗅覚（O）または視覚（V）学習で訓練されたハエよりも、嗅覚（OR）または視覚（VR）手がかりのみで記憶が呼び出された場合に有意に優れたパフォーマンスを示しました。 g. 左上、γd KC の概略図。 左下、温度変化を伴うトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 ぎ。 MB607B-GAL4 を使用したテスト中の γd KC の出力をブロックします。 UAS-Shits1 は、一致 (g)、不一致 (h)、および嗅覚検索 (i) プロトコルにおける 3 時間の記憶パフォーマンスを変更します。 j. 左上、γd KC の概略図。 左下、一定の許容温度でのトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 jl MB607B-GAL4 のメモリ性能。 一致(j)、不一致(k)、および嗅覚回復(l)プロトコル後のUAS-Shits1ハエは、ハエが23℃で訓練およびテストされた場合には影響を受けなかった。 アスタリスクは有意差を示します (P < 0.05)。 データは平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。 ドットとして表示された個々のデータ ポイントは、独立した実験に対応します。 mとn。 左上、単感覚嫌悪トレーニングと匂いイメージング プロトコル。 左下、γd KCのγ1領域(m)とγ5領域(n)の撮像面。 中央、CS+ および CS- の臭気誘発活性の痕跡。 単感覚嫌悪トレーニングは、いずれのγd KC領域でも臭気反応を変化させません。 そう、定量化です。 oとp。 左上、対のない嫌悪性多感覚トレーニングと匂いイメージングプロトコル。 色と匂いの表現はショックを伴うものではありませんでした。 左下、γd KCのγ1領域(o)とγ5領域(p)の撮像面。 中央、CS+ および CS- の臭気誘発活性の痕跡。 不対多感覚嫌悪トレーニングは、いずれの γd KC 領域でも臭気反応を変化させません。 そう、定量化です。 すべての痕跡と定量化について、CS+ と CS- の提示には、他のすべての実験と同様に、匂いが 50:50 で交互に繰り返されました。 臭気誘発活性トレースは、SEM (影) で平均 (実線) を示します。 水平の破線はベースラインのアクティビティを示します。 痕跡の下の黒い線は、5 秒間の臭気曝露を示します。 アスタリスクは、平均した CS+ 応答と CS- 応答間の有意差を示します (P < 0.05)。 個々のハエの CS+ および CS- 応答は破線で結ばれています。 グループは、一元配置分散分析とテューキー検定 (bd、gl)、対応のない両側 t 検定 (e、f)、および対応のない両側 t 検定 (mp) を使用して比較しました。正確な P 値と比較は補足に示されています。情報。 各実験の N 値は次のとおりです: b、g、il、n = 8。 c、e、f、h、n = 10; d、n = 12; m、n、n = 22 ハエ。 o、p、n = 24 匹のハエ。

ａ． DPM ニューロン神経突起の 2 次元樹状図投影 (青緑色の色合い)。 水平葉のγ2-γ5区画の背側枝は濃い青緑色で、残りのγ葉の突起は中程度の青緑で、他の葉の突起は明るい青緑です。 注: γ 葉神経突起を除くすべての神経突起は、視認性を高めるために縮小されています。 ストララー次数が 1 未満の神経突起は枝刈りされ、それに応じて接続性が表示されます。 γ1 コンパートメントの突起は顕著であり、γ2-5 コンパートメントでは背側枝と腹側枝に分かれています。 マーキングは DAN 接続に応じて行われます (斜線部分)。 シナプス (球) は、γ 葉コンパートメント内でのみマークされます。 接続構造は、γd KC (黄色の球) からの入力と γm KC (灰色の球) への出力が DPM ニューロンのコンパートメント特異的分岐上に共局在していることを示しています。 APL入力（マゼンタ）は背側枝と腹側枝の両方に分布し、α'1コンパートメントの垂直葉の基部にある分岐点の周りに集中しています（アスタリスク）。 注: 背側 γ 葉枝の一部の推定部分は、DAN 入力が不足しているため、コンパートメントに割り当てることができませんでした。 γ KC シナプス (ハッシュタグ) を持つ 1 つの枝は、正中線近くの MB に入る β' 葉枝として同定されました。 γ KC シナプスを持つ他の DPM 神経突起先端は、治癒により自由に浮遊する γ 葉の枝が他の葉を神経支配する DPM 神経突起に融合したアーチファクトである可能性があります。 b. APL ニューロン神経突起の 2 次元樹状図投影 (マゼンタ)。 注: ストララー次数が 1 未満の神経突起は枝刈りされ、それに応じて接続性が表示されます。 (a)と比較してください。 PPL1-γ1pedc および PAM-γ5 DAN 入力シナプス (それぞれ赤と緑の球) は、γ1 および γ5 コンパートメント (斜線領域) にマークされています。 DPM ニューロン (青緑の球) へのシナプスは DAN 入力と共局在します。

aとb。 上、APL ニューロンの構造。 一定の制限温度でのトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 下、tubPGAL80tsを用いたAPLニューロンにおけるDop2Rの成人制限RNAiノックダウン;VT43924-GAL4.2は、多感覚食欲訓練後の6時間の嗅覚想起記憶能力を低下させ(a)、単感覚嗅覚学習後の記憶力を低下させた(b)。 cとd。 (a) と (b) の許容温度 (23 °C) 制御実験。 上、温度変化を伴うトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 ハエを 23 °C で飼育、訓練、テストした場合、嗅覚検索 (c) および嗅覚学習 (d) 後の tubPGAL80ts;VT43924-GAL4.2、UAS-Dop2R RNAi ハエでは、記憶性能は影響を受けませんでした。 eとf。 上、温度を含むトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 下、食欲多感覚記憶（e）および嗅覚学習後の記憶（f）の6時間の嗅覚想起は、tubPGAL80tsを使用したAPLニューロンにおけるDopEcRの成人制限RNAiノックダウンの影響を受けませんでした。 VT43924-GAL4.2。 アスタリスクは有意差を示します (P < 0.05)。 データは平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。 ドットとして表示された個々のデータ ポイントは、独立した実験に対応します。 すべてのグループは、一元配置分散分析とテューキー検定を使用して比較され、正確な P 値と比較は補足情報に記載されています。 各実験の N 値は次のとおりです: a、b、n = 12。 c、d、n = 8; e、f、n = 10。

ａ． 図5c、dの許容温度（23℃）制御実験。 上部、トレーニングとテストのタイムライン。 下、VT64246-GAL4 の嗅覚検索によって誘発される多感覚記憶パフォーマンス。 ハエを 23 °C で訓練およびテストした場合、UAS-Shits1 ハエは影響を受けませんでした。 b. 上、温度変化を伴うトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 一番下、テスト中に DPM ニューロンからの出力をブロックすると、多感覚記憶の視覚的検索が損なわれました。 c. 拡張データの許容温度 (23 °C) 制御実験 図 7b。 上部、トレーニングとテストのタイムライン。 下、VT64246-GAL4 の視覚検索によって引き起こされる多感覚記憶パフォーマンス。 ハエを 23 °C で訓練およびテストした場合、UAS-Shits1 ハエは影響を受けませんでした。 d. 上、温度変化を伴うトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 最後に、単感覚トレーニングおよびテスト中に DPM ニューロンからの出力をブロックしても、嗅覚学習のパフォーマンスには影響しませんでした。 e. 左上、γ KC の概略図。 例えば。 上、温度変化を伴うトレーニングとテストのタイムライン (破線)。 下は、MB009B-GAL4 を使用したトレーニング中の γ KC の出力のブロック。 UAS-Shits1は6時間の嗅覚学習能力（e）には影響を与えなかったが、嗅覚想起（f）と視覚想起（g）の記憶能力は著しく損なわれた。 hと私。 拡張データの許容温度 (23 °C) 制御実験 図 7f、g。 上部、トレーニングとテストのタイムライン。 下は、MB009B-GAL4 の嗅覚検索 (h) または視覚検索 (i) によって誘発される多感覚記憶パフォーマンス。 ハエを 23 °C で訓練およびテストした場合、UAS-Shits1 ハエは影響を受けませんでした。 jとk。 左、食欲不覚（匂い）トレーニングと匂いイメージングのタイムライン。 DPM ニューロンの γ5 (j) および γ1 (k) 領域のイメージング平面。 そう、定量化です。 嗅覚訓練の 6 時間後、DPM ニューロンの γ5 (j) および γ1 (k) 領域は、CS+ および CS- の匂いの両方に対して区別できない興奮性反応を示しました。 kとl。 一番上は、食欲の多感覚 (色 + 匂い) または単感覚 (匂い) のトレーニングと匂いイメージングのタイムラインです。 DPM ニューロンの γ5 領域のイメージング平面。 下の図は、多感覚 (l) と単感覚 (m) の両方のトレーニングの 1 時間後の DPM ニューロンの γ5 応答の定量化で、CS- 臭気よりも CS+ に対する興奮性反応が増強されたことを示しています。 nとo。 一番上は、食欲の多感覚 (色 + 匂い) または単感覚 (匂い) のトレーニングと匂いイメージングのタイムラインです。 DPM ニューロンの γ1 領域のイメージング平面。 下は、多感覚 (n) と単感覚 (o) の両方のトレーニングの 1 時間後の DPM ニューロンの γ1 応答の定量化で、CS+ の匂いと CS- の匂いに対する興奮性反応の間に差がないことが示されました。 pとq。 上、γd KC の γ1 (p) および γ5 (q) 領域の撮像面。 左下のパネルは、生理食塩水中でのベースライン記録（300秒；図示せず）に続いて、100μM 5-HTを300秒間灌流し、その後、生理食塩水中で300秒間洗い流した。 浴の塗布と洗い流しの平均トレースが表示されます。 右、定量化は、ベースライン (前) およびウォッシュアウト後と比較して、両方の領域で 5-HT 適用に対する興奮性反応 (平均 – ΔF/F0 の増加) を示しています。 r. 左上、γd KC の概略図。 左下、トレーニングとテストのタイムライン。 右、MB607B-GAL4 で 5-HT2A を RNAi ノックダウンしたハエでは、6 時間の嗅覚学習能力は影響を受けません。 アスタリスクは有意差を示します (P < 0.05)。 データは平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。 ドットとして表示された個々のデータ ポイントは、独立した実験に対応します。 s. 左、食欲多感覚（色+匂い）トレーニングとカラーイメージングのタイムライン。 γd KC軸索のγ5領域のイメージング平面。 中央、CS+ および CS- の色誘発活動の痕跡。 γd KC 軸索の γ5 領域は、CS+ と CS- の両方の色の興奮性反応を示しました。 そうです、色によって引き起こされる反応の定量化です。 追跡およびすべての定量化では、他のすべての実験と同様に、CS+ および CS- の提示には、匂いおよび/または色の 50:50 の交互の変化が含まれていました。 色誘発活性トレースは、平均 (実線) と SEM (影) を示します。 (秒) の垂直の灰色のバーは 0.75 秒のカラー表示 (画像取得がシャットダウンされたとき) に対応し、ボックスは 1.75 秒の定量化期間に対応します。 水平の破線はベースラインのアクティビティを示します。 アスタリスクは、平均した CS+ 応答と CS- 応答間の有意差を示します (P < 0.05)。 個々のハエの CS+ および CS- 応答は破線で結ばれています。 グループは、一元配置分散分析とテューキー検定 (ae、gi、r)、クラスカル・ウォリス H 検定とダン検定 (f)、対応のある両側 t 検定 (jo、s)、および一元配置反復測定を使用して比較しました。 Tukey の検定 (p,q) を使用した ANOVA、正確な P 値および比較は補足情報に記載されています。 各実験の N 値は次のとおりです: ac、r、n = 8。 d、n = 12; ei、n = 8; j、k、n、n = 18 ハエ。 l、m、o、s、n = 16 ハエ。 o、p、n = 10。

n 値、記述統計、および図の正確な P 値による統計分析。 1～5。

n 値、記述統計、および拡張データ図の正確な P 値による統計分析。 1～7。

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転載と許可

オクレイ、Z.、ジェイコブ、PF、スターン、C. 他多感覚学習は、ニューロンをクロスモーダル記憶エングラムに結合します。 Nature 617、777–784 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-06013-8

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受信日: 2022 年 7 月 7 日

受理日: 2023 年 3 月 24 日

公開日: 2023 年 4 月 26 日

発行日: 2023 年 5 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06013-8

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