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Scientific Reports volume 12、記事番号: 11874 (2022) この記事を引用

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Ti とその合金は、化学的特性と機械的特性、生体適合性、人体に対する無毒性の優れた組み合わせにより、最もよく使用されている金属生体材料デバイスです。しかし、現在利用可能な合金には、Al や V の細胞毒性や人骨と比較して弾性率が高いなど、いくつかの問題がまだあります。 β型合金は、α型や（α＋β）型Ti合金に比べて弾性率が低く、機械的強度が高い合金です。次に、Mo や Nb などの非細胞毒性合金元素を使用した新しい生体医学用 β 型合金が開発されています。そこで、アルゴンアーク溶解によりTi-5Mo-xNb系合金を作製した。化学組成はEDS分析により評価し、密度測定はアルキメデス法により実施した。合金の構造と微細構造は、X 線回折、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡によって得られました。微小硬度値が分析され、細胞毒性を評価するために MTT およびクリスタルバイオレットテストが実行されました。 Nb 濃度が増加すると、β-Ti 相の存在も増加し、Ti-5Mo-30Nb 合金は単一の β-Ti 相を示します。対照的に、Ti-5Mo-10Nb 合金を除き、合金の微小硬度は Nb の添加により低下します。Ti-5Mo-10Nb 合金は、おそらくω相の析出により微小硬度が増加します。生物学的インビトロ試験では、合金が細胞毒性がないことが示されました。

現在、世界中で高齢者の数が増加しています。その結果、より良い生活の質と加齢関連疾患の臨床治療を提供するために、股関節や膝のインプラントなどの硬組織に代わる材料の需要も増加しています1、2。 Ti 合金は、高い機械的強度、優れた耐食性、低い弾性率、優れた生体適合性などの優れた特性により、生物医学用途で広く使用されています3。 CP-Ti および Ti-6Al-4V 合金はインプラント材料として広く使用されています4。しかし、V イオンは細胞毒性があり、体内で有害反応を引き起こす可能性があり、Al イオンはアルツハイマー病などの神経疾患を誘発する可能性があることが研究で示されています 2,5。したがって、すでに知られている Ti 合金の特性を維持しながら、Al と V を含まない新しい合金が開発されています。この問題を克服するために、Ta、Zn、Sn、Nb、Mo などの無毒で非アレルギー性の β 安定化元素が使用されます。これらの元素により、機械的強度が高く、弾性率が低い Ti 合金が生成されます6。

一部の研究では、放出される Mo イオンが有毒である可能性があることが示されています 7,8 が、他の研究では、Ti-15Mo10、Ti-15Mo-5Mn11、Ti-12Mo-6Zr-2Fe (TMZF) など、Mo を含む Ti 合金が優れた生体適合性を示す 9 ことを示しています 12 。他の研究では、Ti-Mo14 や Ti-Mo-Ta15 など、Mo を含む Ti 合金が良好な機械的適合性を示すことが示されています 13。また、Karthega ら 16、Oliveira ら 17、Zhou ら 18 は、Ti-Mo 合金が模擬体液に対して優れた耐食性を有することを示しました 13。他の研究では、Ti-Mo-Nb 合金が良好な機械的特性、耐食性 19、20、21、および適切な in vitro 生体適合性 22 を示すことが示されています。 Mo は強力なβ安定化元素でもあります。したがって、高濃度では原子の結合エネルギーが増加し、合金の弾性率が増加する傾向があります23。したがって、Mo 濃度が低い Ti-Mo-Nb の三元合金に関する研究の数が少ないため、Nb の含有量を低含有量から高含有量まで変化させ、合金の弾性率の増加と細胞毒性の可能性を回避することを目的としています。 Mo は、合金中にわずか 5 重量％の Mo 元素を使用して作業するために選択されました。

さらに、ブラジルは世界のニオブ資源の約90％を有しており、世界生産量の約95％を占めています。このように、ブラジルはニオブの世界資源をリードしているため、経済的かつ戦略的な観点から、ニオブを含む合金の加工と開発に関する研究に投資することが極めて重要である24,25。

この研究では、新しい Ti-Mo-xNb (x = 0、10、20、および 30 wt%) 合金系をアルゴンアーク溶解によって調製し、少量の合金の機械的特性に対する Nb の影響を評価しました。もー。

表 1 に EDS によって得られた化学組成を示します。化学組成が公称値に近いままであることが観察できます。図 1 は、調査した各鋳放しインゴットの EDS スペクトルを示しています。合金元素 (Ti、Mo、Nb) のピークのみが観察されており、製造されたサンプルの品質が良好であることを示しています。図 2 は、溶解後の各製造合金の EDS 元素マッピングを示しています。要素がよく分布していることが観察されます。凝集および分離した要素は観察されず、インゴットの優れた均質性が示されました。視覚的にわかりやすくするために、研究対象のシステムの要素をさまざまな色でラベル付けしました。Ti は赤、Mo は緑、Nb は青です。

EDSによる鋳放しTi-5Mo-Nb系合金の定性化学分析。

EDS による鋳放しの Ti-5Mo-Nb 系合金の元素 Ti (赤)、Mo (緑)、および Nb (青) の化学マッピング。

図 3 は、測定された密度と合金のそれぞれの計算された理論密度の比較を示しています。理論的密度と実験的密度は近いままであり、製造された合金の化学量論が適切であることの証拠となった。

Ti-5Mo-Nb系合金の理論密度と実験密度の比較。

合金の Nb 含有量が増加すると密度の増加が観察され、Ti-5Mo 合金の 4.66 g/cm3 から Ti-5Mo-30Nb 合金の 5.48 g/cm3 までの範囲になります。この増加は、合金元素の Mo（10.22 g/cm3）および Nb（8.58 g/cm3）の密度が Ti（4.54 g/cm3）の密度よりも高いためでした26。

AISI 316L (7.93 g/cm3) や CoCr 合金 (9.2 g/cm3) などの他の金属生体材料と比較した場合、調査対象の合金の密度値は低いままであり、値は CP-Ti (4.5 g/cm3) に比較的近いです。 /cm3) および Ti-6Al-4V 合金 (4.42 g/cm3)27。

X 線パターンを図 4 に示します。鋳放しの Ti-5Mo 合金は主に α' 相 (63%) で構成され、22% の α" 相と少量の β 相 (合金に 10 重量％の Nb を添加すると、依然として Ti の 3 相が存在しますが、α" 相とβ 相の量はそれぞれ 50% と 38% に増加し、減少しました。 α'相の12%まで。準安定β合金として予測された Ti-5Mo-20Nb 合金は、α" 斜方晶系相 (40%) と β 相 (60%) のピークを示しました。最後に、Ti-5Mo-30Nb 合金は、β 相のピークのみを示しました。したがって、Nb の添加により、Ti-5Mo-xNb 系合金の微細構造におけるβ相含有量が増加し、30 重量％の Nb で、溶解後はβ相が優勢な合金。

鋳放しのTi-5Mo-Nb系合金のX線回折図。

Ti-Mo28,29 および Ti-Nb30,31 合金のより単純な表現は存在しますが、Zhang ら 30,31 によって提案された図は、広い α + β 場による広範囲の過渡状態と相変態を示しています。低温では、すべての Nb 濃度でω相の形成が示されています。 Nb30 の濃度が 14 重量％未満と 14 ％を超える場合、α' および α" マルテンサイト相の形成がそれぞれ図にさらに追加されました。この α' から α" への相変化は、調査対象の合金の 10 ～ 20 重量% で発生しました。 Nbの。

高い冷却速度により、β 相領域から α' マルテンサイト相が形成されます。粗い針状形態を特徴とするその微細構造は、β 相から α 相への拡散成長が欠如していることに起因します 32。マルテンサイトα" 相も針状形態を特徴としますが、α' 相よりも薄く、外部の機械的変形または高い冷却速度を適用することによって生成でき、β 安定化元素の濃度が α' 相よりも高い場合に形成されます。 α' 相 32. ω 相は、機械的変形、急冷、または熱老化処理によって形成できます 32、33。

OM および SEM 画像を図 5 に示しますが、これは X 線結果と裏付けられています。 Ti-5Mo 合金および Ti-5Mo-10Nb 合金の微細構造では、β 相に特徴的な粒界に加えて、それぞれ α" 相と α' 相に典型的な微細および粗大な針状針状結晶が確認されました。 5Mo-20Nb および Ti-5Mo-30Nb 合金には、β 相の特徴である等軸粒界のみがあります 34,35。

鋳放しの Ti-5Mo (a)、Ti-5Mo-10Nb (b)、Ti-5Mo-20Nb (c) 合金の 1000 × 倍率の OM (左) と 4000 × 倍率の SEM (右) Ti-5Mo-30Nb (d) 合金。

合金のビッカース微小硬度値を図 6 に示します。赤い基準線で示すように、すべての合金は CP-Ti (148 HV) よりも高い微小硬度を持っています。 10% の Nb を添加すると、微小硬度値は 300 HV から 515 HV に増加します。 Xu ら 19 は、Ti-15Mo-xNb 系合金を研究し、10% の Nb を含む合金の微小硬度値の増加も得ました。これは、材料をより硬く脆くする ω 相の形成によって引き起こされる可能性があります 36 、37、38。 20% および 30% の Nb を添加すると、微小硬度値はそれぞれ 330 HV および 200 HV に低下します。この減少は、これらの合金におけるβ相の増加によって説明できます。これは、β安定化元素の増加により化学結合強度が低下し、塑性変形が促進されるため、合金の硬度値が低下する傾向があります39、40、41。合金の微小硬度の低下は、合金の機械的構造を容易にするため重要です39。 Ti-5Mo 合金の微小硬度は AISI 316L (289 HV) および Ti-6Al-4 V (304 HV) に近いままでしたが、Ti-5Mo-30Nb 合金はこれらの同じ金属生体材料よりもはるかに低いままでした。

他の金属生体材料と比較した、鋳放しの Ti-5Mo-xNb 系合金のビッカース微小硬度。

骨の構造は動的であり、その組織は加えられる負荷に応じて変化します42。表 2 は、人間の皮質骨の平均と比較した、研究した合金のビッカース微小硬度値を示しています。

ISO10993 規格 44 を使用すると、生体材料は細胞生存率が 70% 未満の場合にのみ細胞毒性とみなされます。研究された合金は細胞毒性効果を示さなかった(図7、左パネル)。培地中の細胞は、合金に条件付けされた後でも生存し続けており、これは、MTT が分析する細胞のミトコンドリア経路の活性化によって観察できます。

鋳放しの Ti-5Mo-Nb 系合金およびその他の金属生体材料の細胞生存率 (左) および接着 (右) アッセイ。

細胞接着に関しては、図 7 に示すように、分析したすべての合金が対照グループを上回るパーセンテージを維持しており、細胞の生存に不可欠な要素である分析した培地中の細胞接着が刺激されていることを示しています。研究した合金を比較したときに見つかった差異は、他の合金を評価して以前に報告したように、細胞の性能を変更する際にさらなる動的能力を備えた元素を放出できるようになると、細胞培養培地と相互作用する合金の能力に関連している可能性があります45。 46、47。簡単に言うと、合金から放出された元素は、主にインテグリンの活性化に関連し、キナーゼとホスファターゼの作用のバランスを必要とするさまざまな細胞内シグナル伝達を駆動する必要があります 48,49 が、このメカニズムをよりよく理解するには、新しい実験的アプローチをさらに検討する必要があります。ただし、細胞を古典的な細胞培養条件下で維持した場合、調査した合金はすべて、対照と比較してより高い接着を促進したことに言及する必要があります。

得られた結果から、次のことがわかります。

EDS による半定量的な化学組成により、製造されたインゴットの優れた品質と、サンプルの構成要素が最初に提案された公称組成に近いことが確認されます。

サンプルの化学マッピングでは凝集物や分離した元素は示されておらず、製造されたインゴットの均質性が良好であることが示されています。

合金の密度は低いままで CP-Ti に近く、ニオブの量が増加するにつれて増加しました。

合金の微細構造は、Nb の添加に敏感であることが判明しました。合金の Nb 含有量が増加するにつれて、β 相の量が増加し、Ti-5Mo-30Nb 合金ではこの相のみが存在しました。

ビッカース微小硬度値は、おそらくその微細構造中にω相が存在するため、微小硬度が増加したTi-5Mo-10Nbを除いて、Nbの増加とともに減少した。

細胞毒性試験では、この合金には細胞毒性がなく、細胞の生存を維持し、細胞接着を刺激することが示されており、この合金が健康分野で使用される生体材料として大きな可能性を秘めていることが示されています。接触角測定により、細胞接着をより適切に分析できます。

サンプルは、前駆体材料として市販の純粋な Ti グレード 2 (CP-Ti、Sandinox)、Mo (純度 99.9%、Sigma-Aldrich)、および Nb (純度 99.8%、Sigma-Aldrich) を使用して製造されました。金属は、各合金の公称組成で分離されました。不活性で制御されたアルゴンガス雰囲気中で、タングステン電極を備えたアーク溶解炉を使用して、約 60 g のインゴットを溶解しました。各サンプルの均一性を確保するために、インゴットは 5 回再溶解されました。

溶解後、SEM 装置に接続されたオックスフォード INCA モデル検出器を使用して、エネルギー分散分光法 (EDS) 法によって化学組成測定を実行し、インゴットの化学特性を評価しました。さらに、サンプルの密度値はデジタル天秤でアルキメデス法により測定されました。

構造および微細構造の分析は、X 線回折法 (XRD)、光学顕微鏡 (OM)、および走査型電子顕微鏡 (SEM) によって実行されました。 XRD 測定は、Panalytical X'Pert-Pro モデルで、Cu-Kα 放射線、30 mA 電流、40 kV 電位、連続時間モードで実行されました。 OM および SEM 画像は、光学顕微鏡 (Olympus BX51M モデル) および Carl Zeiss 顕微鏡 (EVO-015 モデル) で取得されました。 XRD パターンのリートベルト精密化は、金属チタン相の結晶学的データシート 52 を使用して、EXPEGUI インターフェース 51 を備えた GSAS ソフトウェア 50 によって実行され、装置の実験的寄与を排除するために標準 Ti-cp サンプルが使用されました 23。

微小硬度の測定は、島津製作所 HMV-2 モデル装置で、各サンプルに 5 つのくぼみ、荷重 25 gf、持続時間 10 秒で行われました。測定は ASTM E92 規格 53 に基づいて行われました。

MTT とクリスタルバイオレットの生物学的試験は、製造された合金のサンプルと接触したときの細胞の生存率と接着性を検証するために実行されました。合金の細胞毒性の可能性を検証するために、ISO 10,993 規格 44 に従って、合金を細胞培養中に 24 時間保持しました。条件付け期間の後、細胞培養培地 (αMEM; Sigma) を収集し、10% ウシ胎児血清 (FBS) (Nutricell、カンピナス、SP、ブラジル) を補充し、前骨芽細胞を 24 時間処理するために使用しました。前骨芽細胞 (MC3T3-E1、サブクローン 4) は ATCC から入手し、製造元のガイドラインの推奨に従ってこの研究で維持しました。簡単に説明すると、細胞は、10% ウシ胎児血清を添加した抗生物質 (100 U/mL ペニシリン、100 mg/mL ストレプトマイシン) を含む特定の細胞培養培地を使用したインキュベーター内で、5% CO2、37℃、湿度 95% に維持されました。細胞を処理の24時間前に96ウェルプレートに5×104細胞/mlの密度で播種しました。調整された細胞培養物に所定の時間曝露した後、MTT テストを使用してこれらの細胞の生存率を測定しました。培地を除去したところで、１ｍｇ／ｍｌのチアゾリルブルーテトラゾリウム臭化物塩（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ＃Ｍ５４５５－１Ｇ）を加え、オーブンにさらに３時間置いた。この期間の後、細胞培養物を取り出し、0.1mlのDMSOを加えて、生細胞によって形成された色素を可溶化した。その後、Biotek SYNERGY-HTX マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、570 nm で吸光度を測定しました。

細胞接着アッセイでは、前骨芽細胞を合金で調整した培地に播種しました。細胞を96ウェルプレートに5×104細胞/mlの密度で播種しました。 24時間後、媒体を除去し、クリスタルバイオレットを組み込むことによって接着力を測定した。 Biotekマイクロプレートリーダーで540nmで吸光度を測定した。結果は平均±標準偏差（SD）として表されました。これらは、グループのすべてのペアを比較するための Tukey ポストテストを使用した一元配置分散分析 (パラメトリック) を使用して検証されました。この場合、p < 0.05 は統計的に有意であるとみなされ、p < 0.0001 は高度に有意であるとみなされます。使用したソフトウェアはGraphPad Prism 7です。

この研究の結果を裏付けるデータは責任著者から入手できます。

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著者らは、熱間圧延装置を使用してくださった Oscar Balancin 教授と Rover Belo (UFSCar) に感謝したいと思います。この研究は、ブラジル高等教育人材改善調整機構 (CAPES) の財政コード 001、CNPq (補助金 # 308.204/2017-4) および FAPESP (補助金 #2015/50.280-5 および 2020/03.257) によって一部資金提供されました。 -6)。

非弾性および生体材料研究所、UNESP - Univ Estadual Paulista、バウル、SP、17.033-360、ブラジル

ジョバナ・コロンバロ・カルドーゾ、ダンテ・オリバー・ギム・コレア、ディエゴ・ラファエル・ネススペック・コレア、カルロス・ロベルト・グランディーニ

IBTN-Br – 生体材料・摩擦腐食・ナノ医療研究所 – ブラジル支部、バウル、SP、17.033-360、ブラジル

Institute of Biosciences, UNESP - Univ Estadual Paulista、Botucatu、SP、18.618-689、ブラジル

ゲルソン・サントス・デ・アルメイダ & ウィリアン・フェルナンド・ザンブッツィ

サンパウロ大学バウル歯学部、バウル、SP、17.012-901、ブラジル

マリリア・アフォンソ・ラベロ・ブザラフ

IFSP – サンパウロ連邦教育科学技術研究所、ソロカバ、SP、18.095-410、ブラジル

ディエゴ・ラファエル・ネススペック・コレア

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GC: 概念化、方法論、調査、執筆—原案。 GA 方法論、生物学的調査。 DC: 生物学的調査。 WZ: リソース、生物学的調査、データキュレーション、検証。執筆 - レビュー。 MB: 方法論、リソース、データキュレーション、ライティング – レビュー。 DC: 構造調査、方法論、リソース、データキュレーション、執筆 - レビュー。カルロス・グランディーニ: 監修、資金調達、リソース、執筆 - レビューと編集。すべての著者は論文の出版版を読んで同意しています。

カルロス・ロベルト・グランディーニへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

カルドーソ、GC、デ・アルメイダ、GS、コレア、DOG 他生物医学用途向けの新規鋳放しTi-Mo-Nb合金の調製と特性評価。 Sci Rep 12、11874 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-14820-8

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受信日: 2022 年 3 月 14 日

受理日: 2022 年 6 月 13 日

公開日: 2022 年 7 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14820-8

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