ミクログリアの発生

Communications Biology volume 5、記事番号: 1224 (2022) この記事を引用

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25 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ここでは、ミクログリア/マクロファージ特異的イオン化カルシウム結合アダプター分子 1 (Iba1) の 1.7 kb の推定プロモーター領域と、マイクロ RNA の反復 miRNA 標的部位 (miR) を含むミク​​ログリアを標的とするアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターについて説明します。 )-9 および miR-129-2-3p。 Iba1 (Aif1) 遺伝子のエクソン 1 の開始コドンの上流にある 1.7 kb のゲノム配列は、線条体および小脳においてミクログリア優先プロモーターとして機能します。 さらに、非ミクログリア細胞における異所性導入遺伝子発現は、非ミクログリア細胞およびスポンジ状 AAV のみで発現される miR-9 および miR-129-2-3p の 4 反復 miRNA 標的部位の 2 セットを追加すると、著しく抑制されます。由来のmRNA。 当社のベクターは、健康な組織の分枝状ミクログリアと、リポ多糖類処理マウスおよび神経変性疾患のマウスモデルの反応性ミクログリアに形質導入しました。 さらに、ライブ蛍光イメージングにより、ミクログリアの運動性と細胞内 Ca2+ 動員のモニタリングが可能になりました。 したがって、ミクログリアを標的とする AAV ベクターは、特に線条体および小脳におけるミクログリアの病態生理学および治療法を研究するのに貴重です。

ミクログリアは中枢神経系 (CNS) に存在する免疫細胞であり、監視機能と消去機能を提供することが知られています。 しかし、より最近の研究では、脳の発達 1,2、神経回路のリモデリング 1,3、神経変性疾患の進行 4,5,6 など、CNS におけるミクログリアの多様な機能が明らかになりました。

最近の技術の進歩により、光記録用の G-CaMP (カルシウムセンサー)7 や ArcLightning (膜電圧センサー)8 など、光遺伝学用の多様な光感受性イオンチャネル 9 など、蛍光タンパク質でタグ付けされたさまざまな機能分子のウイルス発現が可能になりました。 このような状況下では、生体内で脳内のミクログリア細胞に特異的に形質導入するウイルスベクターは、本来の脳環境におけるミクログリアの機能と挙動を探索するための強力なツールとなります。 さらに、ミクログリアは脳の病変部位に化学誘引されます 10,11,12。したがって、形質導入されたミクログリアを利用して、治療用遺伝子産物を損傷組織に送達することができます。

インビボで導入遺伝子をミクログリアに送達するために、Jakobsson のグループは、ハウスキーピング ホスホグリセリン酸キナーゼ (PGK) プロモーターと 4 つの反復された相補的マイクロRNA-9 ターゲット (miR-9.T) 配列を備えたレンチウイルス ベクターを使用しました13。 miR-9 は非ミクログリア細胞では内因的に発現されるが、ミクログリアでは発現されなかったため、miR-9.T を含む導入遺伝子メッセンジャー RNA (mRNA) は非ミクログリア細胞のみでスポンジされ、ミクログリアでの選択的な導入遺伝子発現をもたらしました。 その結果、ラット線条体における形質導入細胞の 70% 以上がミクログリアであることが示されました 13。 しかし、レンチウイルスベクターの導入遺伝子カセット内の PGK プロモーターを強力なサイトメガロウイルス (CMV) プロモーターに切り替えると、ニューロンおよび星状細胞における導入遺伝子発現の顕著な漏洩が引き起こされます 14。 さらに、関連する研究では、ミクログリアの活性化時に miR-9 が誘導されることが示されており 15、16、17 、反応性ミクログリアにおける導入遺伝子発現が抑制される可能性が示唆されています。

以前の研究では、F4/80 や CD6818,19 などのミクログリア特異的プロモーターを含むアデノ随伴ウイルス (AAV) 血清型 2、5 および変異体 6 キャプシド ベクターを使用したミクログリアの形質導入に挑戦しました。 しかし、おそらくプロモーター活性が弱く、AAVキャプシドのミクログリアへの結合能力が低いため、一部の「単一ミクログリア標的化」ではわずかな成功しか得られなかった。 したがって、ミクログリアの効率的かつ選択的な形質導入には、強力なミクログリア特異的プロモーターおよびミクログリア指向性 AAV カプシドが必要です。 天然に単離された AAV カプシドの種類の中で、大脳皮質の AAV1 および AAV9、および線条体の AAV1 は、ミクログリアで高い導入遺伝子発現を引き起こしました。 しかし、線条体の AAV1 は、ミクログリアに加えて、星状膠細胞やニューロンにも優先性を示しました 20。

この研究では、ミクログリア/マクロファージ特異的イオン化カルシウム結合アダプター分子 1 (Iba1)、miR-9.T、そして追加の標的配列は、CNS の非ミクログリア細胞集団で選択的に発現される異なる miRNA である miR-129-2-3p によって相補的に結合します 21、22、23。

ミクログリアのターゲティングをテストするために、図に示すように、miR-9、miR-129-2-3p、または miR-136-5p の四重項 miRNA 標的配列の有無にかかわらず、PGK プロモーターまたは推定 Iba1 プロモーターを運ぶ 5 つの AAV コンストラクトを作成しました（図 1a）。 -e)。 これらの AAV 構築物のミクログリア標的化プロファイルは、大脳皮質 (前頭皮質)、線条体、および小脳の 3 つの異なる脳領域で評価されました。 線条体は、miR-9.T13を含むレンチウイルスベクターを使用した以前の報告と我々の結果を比較するために選択されましたが、これらの脳領域の異常なミクログリア機能はさまざまな神経変性疾患と関連しているため、線条体とともに前頭葉皮質および小脳が選択されました。 、アルツハイマー病や小脳失調症など24、25、26。 一般に、AAV の導入遺伝子発現パターンは、注射量とその後のインキュベーション期間に依存します。 ミクログリアを標的とする特性をスクリーニングするために、比較的高い力価（3.9×1012ウイルスゲノム（vg）/mL;図1f）でのAAVの注射後1週間待機しました。 注射量（大脳皮質に 0.5 μL、線条体に 1 μL、小脳に 10 μL）は、以前の報告を参照していくつかの予備注射試験によって決定されました 13,27。 ミクログリアのターゲティングに最適な AAV コンストラクトを選択した後、ミクログリアの形質導入特異性を最適化するために注射量を減らすことでインキュベーション期間を延長しました。

a ～ e AAV ベクターは、構成的な PGK プロモーター (a) または Iba1 プロモーター (b ～ e) と、それに続く GFP、WPRE、および PolyA で構成されます。 さらに、4 つの反復マイクロ RNA (miR) ターゲット配列 (4 × miR-9.T および 4 × miR-129-2-3p.T または 4 × miR-136-5p.T) の 1 セットまたは 2 セットを、 WPRE 配列とポリ A 配列 (a、c ～ e)。 各構築物は、記載されているように、プロモーターの短縮名 (PGK または Iba1) と組み込まれた miR ターゲットで標識されました。 f マウスは、大脳皮質（0.5 μL）、線条体（1 μL）、および小脳（10 μL）に、異なる用量の各 AAV ベクター（3.9 × 1012 vg/mL）を投与されました。 ウイルス注射の 1 週間後、治療を受けたマウスの脳を免疫組織化学によって検査しました。 GFP増強緑色蛍光タンパク質、Iba1イオン化カルシウム結合アダプター分子1、IHC免疫組織化学、ITR逆方向末端反復、PGKホスホグリセリン酸キナーゼ1、ポリAシミアンウイルス40ポリアデニル化シグナル配列、WPREウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント。

以前の研究では、成体ラットの線条体に PGK プロモーターによって miR-9.T の 4 つの繰り返しコピーを発現するレンチウイルス ベクターを注射すると、ミクログリアが優勢に形質導入されることが示されました 13。 レンチウイルスベクター（AAV9.PGK.miR-9.T；図1a）と本質的に同一である導入遺伝子カセットを保持するAAV2/9ベクターを、大脳皮質、線条体、および小脳に注射した。 注射の 1 週間後、脳をスライスし、GFP と Iba1 について免疫標識しました。 我々は、GFP発現細胞の大部分が分枝状ミクログリアとは異なる形態を有しており、Iba1で共免疫標識されていないことを発見した（補足図1）。 定量分析の結果、GFP陽性細胞に対するGFP陽性細胞およびIba1陽性細胞の比率は、大脳皮質および線条体では約10％以下、小脳では34％であることが示されました（表1および補足図1c）。

これまでに、我々は、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）プロモーター（アストロサイト）28、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）プロモーター（ニューロン）29、L7-6などの細胞型特異的プロモーターを備えたAAVベクターを使用して、特定の細胞集団を標的とすることに成功しました。プロモーター［小脳プルキンエ細胞（PC）］30、およびマウスグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）65（mGAD65）プロモーター（抑制性ニューロン）27。 特に、細胞型特異的遺伝子の最初の ATG の上流のゲノム配列が、細胞型特異的プロモーターとして機能することが多いことがわかりました 27,30。 したがって、私たちはこの戦略を利用することにしました。 以前の研究では、エクソン1、イントロン1、およびエクソン2の一部を含む1.9 kb Iba1（Aif1）ゲノム領域を使用して、ミクログリア特異的トランスジェニックマウスを作製しました（補足図2a）31。 したがって、Iba1遺伝子のエクソン1の最初のATGの上流にある対応するゲノム領域（補足図2a、b）が、AAVベクター（以下、1678 bpマウスIba1）に組み込まれたときにミクログリア特異的に機能するかどうかをテストしました。ゲノム領域は Iba1 プロモーターと呼ばれます)。 Iba1プロモーターを介してGFPを発現するAAV2/9ベクター（AAV9.Iba1）を、AAV9.PGK.miR-9.Tと同じ用量で大脳皮質、線条体、および小脳に注射した（図1b、f）。

注射の1週間後、線条体と小脳でミクログリア（GFPおよびIba1二重陽性細胞）の効率的な形質導入が観察され（補足図3e-gおよびh-j）、一部のIba1陰性非ミクログリア細胞が形質導入されました（補足図3f、g、i、jの矢印）。 対照的に、大脳皮質のほとんどのGFP発現細胞はIba1陰性錐体ニューロン様細胞でした（補足図3b-d）。 定量分析の結果、線条体と小脳の GFP 陽性細胞の約 69% と約 86% が Iba1 陽性ミクログリアであるのに対し、Iba1 陽性ミクログリアは大脳皮質の GFP 発現細胞のわずか 2% しか保持していないことが示されました (表1および補足図3k）。 これらの結果は、Iba1 プロモーターが線条体および小脳の常在ミクログリアで優先的に機能するが、大脳皮質では機能しないことを示唆しています。

ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（WPRE）の後にmiR-9.T配列をAAV9.Iba1に追加しました（AAV9.Iba1.miR-9.T;図1cおよび補足図4a）。 以前の報告では、miR 標的部位の数が増加するにつれて標的抑制レベルが増加することが示されているため、miR 標的配列は 4 回繰り返されました 32、33、34。 4 つの miR 標的部位を有するコンストラクト内の各 miR 標的部位の有効性は、2 つの miR 標的部位を有するコンストラクト内の各部位の有効性より 2 倍大きかったが、6 つの miR 標的部位を有するコンストラクトの有効性と同様であった 35。 標的抑制の有効性と導入遺伝子の収容スペースの節約の観点から、4回の反復を選択しました。

AAV は、3 つの脳領域すべてで分岐ミクログリアを効率的に形質導入しました（補足図 4b-j）。 ただし、大脳皮質では、大きな体細胞を特徴とする多数のIba1陰性非ミクログリア細胞がウイルス注射部位の中心付近に形質導入されましたが（補足図4b、d）、選択的なミクログリア形質導入は離れた領域で観察されました。震源からの距離（補足図4b、c）。 定量分析により、線条体および小脳のほぼすべてのGFP陽性細胞がIba1陽性ミクログリアであったのに対し、大脳皮質では全形質導入細胞に対する形質導入ミクログリアの割合はわずか約27％であったことが明らかになりました（表1および補足図4k）。 したがって、miR-9.T 配列の追加により、3 つの脳領域すべてで非ミクログリア細胞が有意に標的から外れましたが、大脳皮質における非ミクログリアの標的解除は依然として不十分でした。

非ミクログリア細胞における導入遺伝子発現をさらに抑制するために、追加の四重鎖 microRNA-129-2-3p ターゲット (miR-129-2-3p.T) または microRNA-136-5p ターゲット (miR-136-5p.T) を組み込みました。 ）四重鎖miR-9.T（AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.Tまたは136-5p.T）後の配列（図1d、e）。 miR-9 と同様に、miR-129-2-3p と miR-136-5p は両方ともニューロンに富み、ミクログリアでは減少していることが示され 22、miR-129-2-3p と miR-136-5p の両方が抑制を抑制する可能性が高いことを示唆しています。非ミクログリア細胞における miRNA 標的部位を含む導入遺伝子 mRNA の発現。 これらの AAV を 3 つの異なる脳領域に同様に注射し、ウイルス注射の 1 週間後に導入遺伝子発現プロファイルを免疫組織化学的に分析しました。 AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.Tで処理した脳スライスの共焦点顕微鏡分析により、3つの脳領域すべてにおける高度に特異的なミクログリア形質導入が明らかになりました（図2a〜j）。 注目すべきことに、大脳皮質のニューロンは大部分が標的化されていませんでした（図2b-d）。 定量分析により、大脳皮質の形質導入細胞の約 87%、線条体および小脳のほぼすべての形質導入細胞がミクログリアであることが示されました (表 1)。 miR-129-2-3p.Tとは対照的に、miR-136-5p.TをAAV9.Iba1.miR-9.Tに追加しても、大脳皮質の非ミクログリア細胞を脱標的することができませんでした（補足図5） ）。

Iba1プロモーター、GFP、およびmiR-9およびmiR-129-2-3pに相補的な2つの異なる四重鎖配列を含むAAV構築物のスキーム。 マウスには、大脳皮質（0.5 μL）、線条体（1 μL）および小脳（10 μL）に異なる用量の AAV（3.9 × 1012 vg/mL）が投与されました。 ウイルス注射の 1 週間後、マウスの脳を免疫組織化学によって検査しました。 (bd) 大脳皮質の免疫組織化学。 bの正方形の領域を拡大しました。 Iba1陰性の非ミクログリア細胞の形質導入は弱くまれであるが、ミクログリアでは強力かつ効率的なGFP発現が見られることに注目してください(矢印)。 e-j 線条体 (e-g) および小脳 (h-j) におけるミクログリアの高度に特異的な形質導入。 (e、h) の正方形の領域を拡大しました。 スケールバー。 100 μm (b、e、h) および 20 μm (c、d、f、g、i、j)。 GLは顆粒細胞層、MLは分子層。

次に、ミクログリアの形質導入効率を調べました。これは、GFP と Iba1 の二重陽性細胞 (形質導入されたミクログリア) の割合を、Iba1 に対して免疫反応性のあるミクログリアの総数で割ることによって評価されました。 試験した用量のAAVベクターは、3つの脳領域すべてでミクログリアの約50〜90％を形質導入しました（補足図6）。 miR-9.T の存在下では、大脳皮質および線条体において PGK プロモーターから Iba1 プロモーターに切り替えることにより、形質導入効率が大幅に増加しました。 AAV9.Iba1.miR-9.T への miR-129-2-3p.T の追加は、調べた 3 つの脳領域における形質導入効率に影響を与えませんでした。

AAV の直接実質注射は脳微小血管系を損傷し、Iba1 陽性血液由来単球の脳組織への侵入を引き起こす可能性があります。 GFP 標識細胞にこれらの浸潤性単球が含まれているかどうかを確認するために、図 2 に示すように、AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T を線条体と小脳に注射しました。注射、線条体および小脳切片は、GFP、Iba1、およびCNSマクロファージ、樹状細胞、浸潤単球または他の免疫細胞または神経細胞タイプによって発現されない高度に特異的なミクログリアマーカーである膜貫通タンパク質119（TMEM119）について三重免疫標識された36（補足図）。 。 7）。 GFP と Iba1 の二重陽性細胞 (3 匹のマウスの 5 つの線条体切片の n = 299 細胞、および 2 匹のマウスの 3 つの小脳切片の n = 207 細胞) を検査しましたが、そのすべてが TMEM119 に対しても陽性であることが判明しました。 AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.Tを注射した脳組織における浸潤単球の汚染がほとんどまたはまったくないことを示しています。

さらに、形質導入細胞がアストロサイトではないことを確認するために、線条体および小脳切片を、アストロサイトのマーカーであるグリア原線維酸性タンパク質（GFAP）について免疫染色した（補足図8）。 私たちは、GFP と GFAP の二重陽性細胞 (アストロサイト) (3 匹のマウスからの 5 つの線条体切片と 2 匹のマウスからの 3 つの小脳切片) を注意深く検索しましたが、そのような細胞は見つかりませんでした。

AAV注射から3週間後の形質導入プロファイルを調べました（図3a）。 線条体では、ミクログリアを標的とした形質導入は、非ミクログリア細胞でわずかにGFP発現を伴って保存されました（図3b）。 GFP陽性細胞の80％以上がIba1陽性ミクログリアでした（80.6±1.5％、2576個のGFP陽性細胞中2061個の細胞、n = 9マウス）（図3g）。 しかし、小脳では、ミクログリアに対する特異性は約60％（56.1±5.2％、1,637個のGFP陽性細胞中に896個のミクログリア、n = 7マウス）に減少しました（図3c、g）。 小脳には線条体の 10 倍の AAV が投与されたため、注射量を 4 分の 1 (3.9 × 1010 vg/マウスから 1.0 × 1010 vg/マウス) に減らし、その結果ミクログリアが大幅に増加しました。特異性は 83% (82.5 ± 4.9%、1,067 個の GFP 陽性細胞中 890 個の細胞、n = 7 マウス) (図 3d、g)。

AAV コンストラクト (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T) およびウイルス注入の概略図。 図２と同じ用量（高用量；Ｈ）または約４分の１（低用量；Ｌ）で３つの脳領域にＡＡＶを注射したマウスを、注射の３週間後に免疫組織化学により検査した。 b – f 線条体（b）、小脳（c、d）、および大脳皮質（e、f）の免疫組織化学。 注射量はスキーマの上に記載されています。 線条体および小脳におけるIba1陰性非ミクログリア細胞の弱い形質導入を伴うミクログリアにおける強力かつ効率的なGFP発現に注目してください(b、c)。 対照的に、大脳皮質は、錐体ニューロン様形態を示す細胞を含む非ミクログリア細胞において主にGFP発現を示した(e)。 ウイルス用量を 4 分の 1 に下げると、小脳および大脳皮質の非ミクログリア細胞における GFP 発現が抑制されました (d、f)。 スケールバー。 100μm。 g 3 つの脳領域におけるミクログリアの細胞特異性を示す概要グラフ。 グラフ上の数字は、線条体に注入された量を 1 とした場合の、注入された AAV の相対量を表します。箱ひげ図には、中央値 (中心線)、25 から 75 パーセンタイル (箱)、および最小値から最大値 (ひげ) が表示されます。 ) (線条体、1 グループあたり n = 9 マウス、小脳、1 グループあたり n = 7 マウス、両側非対応 t 検定、t(12) = 3.711、**高用量対低用量で P ≤ 0.01、大脳皮質、n = グループあたり 4 匹のマウス、対応のない両側 t 検定、t(6) = 4.513、**高用量対低用量の P ≤ 0.01)。

大脳皮質では、3週間のインキュベーションにより、大脳皮質にもかかわらず、非ミクログリア細胞の広範な形質導入が生じました（4.0±1.3％、718個のGFP陽性細胞中に29個のミクログリア、n = 4マウス、図3e、g）。最低用量のAAVを受けました。 さらに注射量を 4 分の 1 に下げると (1.95 × 109 vg/マウスから 0.5 × 109 vg/マウス)、ミクログリアの特異性は大幅に増加しましたが、依然として 27.3 ± 3.5% (1,316 個の GFP 陽性細胞中 369 個の細胞、 n = 8 匹のマウス;図 3f、g)。 これらの結果は、最適な注射量を選択することで、線条体および小脳のミクログリアを高い特異性で安定して形質導入できることを示唆しています。 しかし、大脳皮質の非ミクログリア細胞における導入遺伝子の発現を抑制することは依然として困難です。

以前の研究では、ミクログリア17および単球15におけるリポ多糖（LPS）処理後のmiR-9産生の誘導が報告されています。 この場合、AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T は、LPS 活性化反応性ミクログリアでは役に立たない可能性があります。 この仮説を検証するために、AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T を初期高用量で注射しました（大脳皮質、1.95 × 109 vg/マウス、線条体、3.9 × 109 vg/マウス。成体マウスにLPS（0.2μg/μL）とともに小脳、3.9×1010vg/マウス）を投与し、その後1週間毎日LPS（1μg/g体重）を腹腔内注射しました（図4a）。 マウスは免疫組織化学のために屠殺された。 3つの脳領域すべての多数のミクログリアで強力なGFP発現が観察されました（図4b-m）。 LPS 処理マウスに形質導入されたミクログリアはアメーバ状の形状をしており、突起が短く厚いことが特徴でした。 これらの結果は、AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.Tによる反応性ミクログリアおよび分岐ミクログリアの効果的な形質導入を示しています。

実験プロトコルを示す図。 AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T および LPS (0.2 μg/μL) を含む溶液を 0 日目に 3 つの脳領域に注射し、続いて LPS (1 ７日目までＬＰＳ注射の６時間後にマウスを屠殺した。脳切片をＧＦＰおよびＩｂａ１について免疫標識した。 b–m 大脳皮質 (b–e)、線条体 (f–i)、および小脳 (j–m) の低、中、高倍率。 (b)、(f)、(j) の正方形領域をそれぞれ (c)、(g)、(k) に拡大しました。 スケールバー: 500 μm (b、f、j)、200 μm (c、g、k)、および 20 μm (d、e、h、i、l、m)。 GL顆粒細胞層、LPSリポ多糖、ML分子層。

ミクログリアは、TLR4 (Toll 様受容体 4) を介して LPS の特定の構造を認識し、炎症誘発性サイトカインの放出を引き起こしますが、神経変性組織内のミクログリアはおそらくスカベンジャー受容体を介して刺激され、アポトーシスを起こした細胞残骸の貪食と細胞の放出を誘導します。抗炎症性サイトカイン37。 したがって、神経変性組織内の反応性ミクログリアは、LPS に曝露されたミクログリアとは異なる miRNA を産生する可能性があります。 次に、AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T が神経変性組織におけるミクログリアの形質導入に使用できるかどうかを調べました。 神経変性モデルとして、特に PC 特異的 L7 プロモーター (B05 系統としても知られる) の制御下で小脳 PC において異常に増大した ATXN1 を発現する脊髄小脳失調症 1 型 (SCA1) トランスジェニック (SCA1-Tg) マウスを選択しました 38。 、39。 24週齢の症候性SCA1-Tgマウスとその野生型同腹子に、低用量のAAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T（1.0×1010vg）を小脳注射した。 /マウス;図5a)。

AAV コンストラクト (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T) およびウイルス注入の概略図。 AAV (用量: 1.0 × 1010 vg/マウス) を、24 週齢の野生型および SCA1-Tg マウスの小脳に注射しました。 ウイルス注射の 3 週間後、小脳切片を免疫組織化学によって分析しました。 b – d 野生型（WT）マウスの小脳のGFP免疫蛍光画像。 e – g SCA1-Tg (B05) マウス小脳の矢状断面の GFP 免疫蛍光画像。 b と e の正方形の領域は、それぞれ c、d、f、g に拡大されました。 スケールバー。 500 μm (b、e) および 20 μm (c、d、f、g)。 GLは顆粒細胞層、MLは分子層。

ウイルス注射の 3 週間後、小脳切片を GFP および Iba1 について免疫標識しました。 共焦点顕微鏡検査により、SCA1-Tg マウスとその野生型同腹子の両方の切片におけるミクログリアの効率的かつ特異的な形質導入が明らかになりました（図5b-g）。 注目すべきことに、SCA1-Tgマウスの小脳では、野生型同腹子よりもはるかに多くのミクログリア集団が形質導入され、これは少なくとも部分的には、同年齢の野生型マウスと比較してミクログリアの密度が著しく増加したためである40。 これらの結果は、神経変性組織内のミクログリアを特異的に標的とするために AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T を拡張します。

ミクログリアの動的な形態学的変化を調べるために、AAV 注射の 7 ～ 12 日後に急性小脳スライスの顆粒細胞層で共焦点ライブ GFP イメージングを実行しました (AAV9-Iba1-GFP-miR-9.T-miR-129-2- 3p.T; 3.9 × 1010 vg/マウス) を小脳に与えます。 ほとんどのGFP標識ミクログリア細胞は基本的な形態学的運動性を示しましたが、運動性の程度は細胞間で異なりました（図6a;補足ビデオ1〜3）。 一部の細胞では、ATP（100μM）の浴適用により、いくらか遅れて運動性の増加が誘導されました（図6bおよび補足ビデオ4および5）。 これらの結果は、ミクログリアの形態学的動態と一致しています 41,42。

a、b 微速度撮影 GFP 蛍光画像 (画像の上に示されている時間) は、a ではミクログリア プロセスの基礎的な動き、b では ATP によって誘導されるミクログリアの運動性上方制御を示しています (100 μM ATP を浴適用したときのフレームは ' として示されています)。 +ATP'; b) の上パネルでは 3 分間、下パネルでは 1 分間の ATP 適用。 a と b の上部パネルと下部パネルは、異なるセルの例に対応します。 スケールバー: 10 μm。

次に、我々のミクログリア選択的遺伝子発現法を、遺伝的にコードされた蛍光カルシウム指示薬 G-CaMP7.0943 からの Ca2+ シグナルの測定に使用できるかどうかを検討しました。 小脳への AAV 注射 (AAV9-Iba1-G-CaMP7.09-miR-9.T-miR-129-2-3p.T; 3.9 × 1010 vg/マウス) の少なくとも 1 週間後に、生共焦点 Ca2+ イメージングを行った。急性小脳スライスの顆粒細胞層で実行されます。 一部のミクログリアは自発的な Ca2+ 活性を示しました（補足ビデオ 6-8; ATP 適用前、および図 7b; ATP 適用前の ROI 3）。 ATP（100μM）の浴適用は、より大きな細胞区画（図7a、おそらくミクログリア細胞体またはより大きなミクログリアプロセス;補足ビデオ7および8）だけでなく、より小さな区画（おそらく図7b、d）でもCa2+の増加を確実に誘発しました。ミクログリア微細突起; G-CaMP 陽性細胞の補足ビデオ 7)。 ATP誘発性Ca2+シグナル変化の平均ピーク振幅（ΔF / Fbasal、方法を参照）は3.36±0.19でした（図7c、2匹のマウスの5つの小脳スライスからのn = 91の細胞区画）。 ミクログリアはプリン作動性受容体を発現し、数秒程度の ATP 誘導性 Ca2+ 応答を示すため、これらの結果は典型的なミクログリアの Ca2+ 動態と一致します 35,44。

a、b 左のパネルは、急性小脳スライスの顆粒細胞層におけるウイルス発現 G-CaMP シグナルの平均共焦点画像を示しています。 関心領域 (ROI 1 ～ 4) は、a では大きなコンパートメント (おそらくミクログリア細胞体またはその大きな突起) に、b ではミクログリアの小さなコンパートメント (おそらくは微細なミクログリア突起) に設定されました。 右のパネルは、左のパネルに示されている ROI の蛍光から推定された Ca2+ シグナル変化の痕跡を示しています。 100 μM ATP (黒色のバーで示す) を浴に適用すると、形質導入されたミクログリアの大きいコンパートメントと小さいコンパートメントの両方で Ca2+ トランジェントが強力に誘発されました。 c ミクログリア細胞区画における浴適用ATP（ΔF / Fbasal、方法を参照）によって誘導される定量化されたCa2+シグナルを示すボックスアンドウィスカープロット。 白丸は個々のデータ ポイントを示します。 水平線とボックスは、それぞれ中央値と四分位範囲を表します。 エラーバーは、平均値の上下の 1 標準偏差を示します (黒丸)。 d G-CaMP7.09を発現するミクログリア突起の動きを示すタイムラプス蛍光画像（白丸で示す）。 白丸の外側の他の G-CaMP 陽性ミクログリア コンパートメントは静的であることに注意してください。

総合すると、これらの結果は、機能的 Ca2+ 指標である G-CaMP タンパク質がこの方法を使用して小脳ミクログリアで首尾よく発現されることを示唆しています。 したがって、我々は、AAV を介したミクログリア特異的遺伝子発現法は GFP 以外の遺伝子の発現にも適用可能であり、我々の方法はミクログリアの生きた形態学的動態を調べるための強力なツールとなり得ると結論付けました。

miR-9 や miR-129-2-3p などの細胞マイクロ RNA は、細胞生存、樹状突起分岐、シナプス可塑性などの細胞機能において重要な役割を果たしています 45、46、47、48、49。 ニューロンおよび/または他の細胞型で過剰発現された miR.T 配列による内在性 miRNA の捕捉は、miRNA の本来の役割を損ない、その結果細胞機能を破壊する可能性があります。 この可能性をテストするために、miR-9.T および miR-129-2-3p.T を含む mRNA を、GFP-miR-を発現する血液脳関門貫通型 AAV-PHP.B の全身適用によって脳全体に過剰発現させました。 9.T-miR-129-2-3p.T、強力なサイトメガロウイルスとニワトリβ-アクチンハイブリッド（CBh）プロモーター50（AAV-PHP.B-CBh-GFP-miR.T）またはAAV-PHP.Bを発現するものを使用同じCBhプロモーターを使用したGFP単独（AAV-PHP.B-CBh-GFP;補足図9a）。 小脳は大脳皮質、脳幹、脊髄などの他の脳領域よりも高レベルの miR-9 および miR-129-2-3p を発現しているため 51、ロータロッドとウイルス注射から3週間後のビームウォーキングテスト。 結果は、どちらの行動試験でも 2 つのグループ間に統計的に有意な差がないことを示しました (t 検定、各グループの n = 5 マウス;補足図 9b、c)。

行動試験後、マウスは組織学的分析のために屠殺された。 対照マウスは、肝臓と脳の両方で強いGFP発現を示しました（n = 5マウス、補足図9dの中央のパネル）。 対照的に、GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.Tを発現するマウスは、肝臓での強いGFP発現にもかかわらず、脳ではほとんどGFP発現を示さなかった（n = 6マウス;補足図の下のパネル）。 9d）。 脳の矢状切片では、miR-9.T-miR-129-2-3p.Tの共発現による脳全体のGFP発現の広範な抑制が確認されました（補足図9eの右上パネル）。 拡大画像は、血管内皮細胞や小脳PCを含む少数の細胞におけるかすかなGFP発現を示しています（補足図9eの中央および右下のパネル）。

miR 標的配列に結合した内在性 miRNA は、ウイルス mRNA とともに分解される可能性があります。 これを調べるために、GFP-miR-9 を発現するマウスの内因性 miR-9、miR-129-2-3p、および miR-129-5p (対照として) のレベルを比較しました。 3p.T、および 3 つの脳組織 (大脳皮質、線条体、小脳) で GFP のみを発現するもの。 その結果、3 つの脳領域すべてにおいて 2 つのグループ間で miR-9、miR-129-2-3p、および miR-129-5p レベルに統計的に有意な差は示されませんでした (t 検定、グループあたり n = 5 マウス、補足図) .9f）。

神経機能に対する miR.T の過剰発現の影響を検証するために、GFP を単独または miR.T (miR-9.T および miR-129) と組み合わせて発現する AAV-PHP.B 処理マウスの小脳の電気生理学的特性を調べました。 -2-3p.T)。

マウスはウイルス注射後 3 週間で屠殺されました。 GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.Tを発現するマウスの小脳切片を高倍率で観察すると、PCがGFPでかすかに標識されていることがわかりました（下のパネル、補足図10a）。 これは、CBh プロモーター駆動の GFP-miR 標的発現が、miR 媒介遺伝子サイレンシングの能力を超えるほど強力であるためである可能性があります。 この研究では、同じプロモーターの制御下でGFPのみを発現する（miR.Tなし）対照PCと比較して、GFP-miR.T陽性PCが機能異常を示すかどうかを電気生理学的に調べました（上のパネル、補足図10a）。

GFP-miR.T 陽性 PC（GFP-miRs.T PC）の受動的電気膜特性は、GFP 陽性 PC（コントロール GFP PC; 補足図 10b、左、膜容量、コントロール GFP PC、 591.6 ± 45.1 pF、n = 18; GFP-miR.T PC、655.6 ± 56.5 pF、n = 14、t 検定、P = 0.377; 補足図 10b、右、入力抵抗、コントロール GFP PC、155.2 ± 38.6 MΩ、n = 18、GFP-miR.T PC、139.7 ± 24.8 MΩ、n = 14、t 検定、P = 0.755)。 細胞外ルーズパッチ記録によってPCの活動電位（スパイク）の自発発火パターンを調べました（補足図10c、左）。GFPとGFPの間で自発的なニューロンスパイク活動の間隔（つまり、自発発火率）に差はありませんでした。 miR.T PC およびコントロール GFP PC（補足図 10c 右、コントロール GFP PC、43.1 ± 6.6 ミリ秒、n = 20; GFP-miR.T PC、34.7 ± 5.8 ミリ秒、n = 15、t 検定、P = 0.369）。 これらの結果は、miR.T の過剰発現が小脳 PC の固有の発火特性に影響を及ぼさないことを示唆しています。

また、平行線維 (PF) から GFP-miR.T PC へのシナプス伝達も調べました。 PF-PC シナプスにおける基本的な興奮性シナプス応答は、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-酸 (AMPA) 受容体を介した興奮性シナプス後電流 (EPSC) を記録することで特徴づけられました。 PF（補足図10d、左）。 GFP-miR.T PCとコントロールGFP PCとの間の刺激強度とEPSC振幅の関係に有意差はありませんでした（補足図10d、右;ホルム・シダック法で補正された複数のt検定、P>0.89）すべての強度)。 PF-PC シナプスにおける短期シナプス可塑性は、最初と 2 番目のパルス間の間隔を変化させた (10 ミリ秒から 5 秒) ペアパルス刺激プロトコルを使用して検査されました (補足図 10e、左)。 パルスペアによって誘発される2番目のPF EPSCの振幅は、最初のPF EPSCの振幅に対して正規化され、比率（つまり、ペアパルス比率）が刺激間間隔に対してプロットされました（補足図10e、右）。 GFP-miR.T PCとコントロールGFP PCの両方が、より短い間隔で同様のシナプス促進を示しました（補足図10e）。これはPF-PCシナプスに典型的です52。GFP-miR間のペアパルス比には統計的な差はありませんでした。 。 T PC およびコントロール GFP PC (二元配置反復測定分散分析、miR 効果、P = 0.35)。 これらの結果は、miR.T の過剰発現が、PF-PC シナプスにおける基礎シナプス伝達や短期シナプス可塑性に影響を及ぼさないことを示唆しています。

次に、AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T の全身適用が脳内のミクログリアの形質導入に成功したかどうかを調べました。 36 週齢の野生型 (WT) マウスと SCA1-Tg マウスに、AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (1.5 × 1012 vg/マウス）を注射し、免疫組織化学検査のために注射の３週間後に屠殺した（図８ａ）。 共焦点顕微鏡検査により、小脳および橋核を含む脳全体に散在するGFP涙点が示されました（WTおよびSCA1-Tgマウス、図8bおよび補足図11）。

36週齢のSCA1-TgマウスにAAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T（用量：1.5×1012vg/マウス）を静脈内注入した。 ウイルス注射の 3 週間後、脳切片が作成され、GFP と Iba1 の二重免疫標識によって分析されました。 (bd) SCA1-Tg マウスの矢状断面 (小葉 II および III) の免疫蛍光画像 (b) および正方形領域の拡大 (c、d)。 SCA1-Tg マウスの小脳のミクログリアにおける GFP の凝集に注目してください。 スケールバー、20μm。 GL; 顆粒細胞層、iv; 静脈内注射、ML; 分子層、SCA1-Tg。 脊髄小脳失調症1型トランスジェニック。

より高い倍率では、GFP涙点がIba1免疫標識ミクログリアに位置していることがわかりました（図8c、d、および補足図11d、e、g、h）。 私たちは、これがミクログリアにおける GFP タンパク質のリソソーム分解プロセスであると推測しました。 これを検証するために、小脳切片を GFP、Iba1、核 DNA (ヘキスト染色を使用)、およびリソソーム膜を横切って位置する糖タンパク質であるリソソーム関連膜タンパク質 1 (LAMP1) について免疫標識しました 53。 推測どおり、GFP凝集体はLAMP1免疫反応性と正確に共局在し（補足図12）、GFP凝集体がミクログリアのリソソームに存在することが示されました。 これらの結果は、AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T の静脈内投与がミクログリア特異的に GFP 発現を引き起こすことを示唆しています。 ただし、脳組織への直接注入とは異なり、GFP はリソソームの消化経路に分類されます。

我々は、1.7 kbのマウスIba1プロモーターと、それぞれが異なるmiRNA、miRに相補的である2セットの4タンデム配列コピーを運ぶAAVベクターを直接脳実質に注射することにより、成体マウスの異なる脳領域におけるミクログリア特異的形質導入に成功した。 -9 および miR-129-2-3p。

内因性遺伝子発現の有無およびレベルは、発生段階に依存し、細胞型に特異的に厳密に制御されています。 対照的に、細胞型特異的プロモーターを使用した AAV 媒介導入遺伝子発現は、限られたゲノム領域のみに及ぶ細胞型特異的プロモーターの取り込みが不十分であり、過剰投与の可能性があるため、この生物学的調節による影響が少なく、異所性導入遺伝子発現が引き起こされます。意図しない細胞タイプで発生します。 これに関連して、ミクログリアに対する高い特異性を持つプロモーターを運ぶ AAV の最適用量の注射は、ミクログリアのターゲティングにとって重要です。 私たちの実験条件下（図1b、f）では、現在の1.7 kbのマウスIba1プロモーターは、線条体（〜69％）および小脳（〜86％）のミクログリアで優先的に機能しましたが、小脳のミクログリアに対してはほとんど特異性を示さなかった。最低用量の適用に関係なく（〜2％）、脳組織の不均一性と1.7 kb Iba1プロモーターの領域特異性を示唆しています（表1および補足図3）。 ウイルスベクターを使用する場合のもう 1 つの欠点は、特に AAV ではパッケージング能力が限られていることです。 Iba1 プロモーターの比較的長いサイズ (1.7 kb) により、導入遺伝子のサイズは最大約 2 kb に制限されます。

我々はミクログリアを標的とした導入遺伝子発現のためにIba1プロモーターを利用しましたが、Iba1プロモーターはまさに骨髄細胞特異的プロモーターであり、髄膜マクロファージ、血管周囲マクロファージ、および脈絡叢マクロファージを含む常在CNSマクロファージで機能することに注意する必要があります。 樹状細胞。 病理学的条件下での浸潤単球。 したがって、AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.Tで形質導入された細胞の微妙な集団には、これらの細胞型が含まれる可能性があります。

マイクロRNAはアルゴノート（AGO）タンパク質をガイドし、miRNA誘導サイレンシング複合体（miRISC）のターゲティングモジュールを形成し、標的mRNAの翻訳抑制と分解を引き起こします54。 miR-9 と miR-129-2-3p は両方とも、非ミクログリア細胞では豊富であるが、ミクログリアでは特異的に減少することが示されました 22。 したがって、標的配列を運ぶ mRNA は miR-9 または miR-129-2-3p を含む miRISC によってスポンジ化され、非ミクログリア細胞における導入遺伝子発現の選択的サイレンシングをもたらします。 懸念の 1 つは、ニューロンを含む非ミクログリア細胞における miRNA の分解と枯渇が同時に起こることです。 ただし、3 つの脳領域の内因性 miR-9 および miR-129-2-3p レベルは、強力な刺激を使用して GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T を過剰発現させた後でも、有意な変化はありませんでした。遍在性CBhプロモーター（補足図9f）、GFP発現は大幅に抑制されました（補足図9d、e）。 この結果は、（今回の場合のように）完全に相補的な標的は、哺乳動物の Ago2 などの触媒作用のある AGO に結合すると切断されるが、標的 mRNA と AGO のペアリングにより miRNA がアンロードされることを示す最近の報告 55 と一致しています。 AGO からの抽出と miRNA のリサイクル。 これと一致して、小脳の運動能力とパッチクランプ分析は、脳全体でGFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.Tを発現するマウスでは有意に変化しなかった（補足図9および10）。 。 それにもかかわらず、他の脳領域におけるニューロン機能の障害、および miR-9.T および miR-129-2-3p.T の過剰発現による行動欠陥との関連を排除することはできません。

miR-129-2-3p.T とは対照的に、miR-136 の発現にもかかわらず、miR-136-5p.T を AAV9.Iba1.miR-9.T に添加しても、非ミクログリア細胞における導入遺伝子発現を抑制できませんでした。ニューロンの-5p21。 以前の研究では、低レベルの miR-155 を発現する未熟樹状細胞は miR-155T を運ぶ導入遺伝子の発現を抑制しないことが示されましたが、miR-155 レベルを上方制御する成熟樹状細胞は顕著な標的抑制を誘導し 32 、これは標的の下方制御が一定の時間で起こることを示唆しています。 miRNA発現の特定の閾値。 この概念は、大脳皮質における miR-136-5p の発現レベルが miR-129-2-3p (および miR-9) の発現レベルよりもはるかに低いことを明らかにした最近の報告によって裏付けられています51。 したがって、非ミクログリア細胞における miR-136-5p の発現レベルは、標的 mRNA 分解の閾値を下回る可能性があります。

健康な組織における分枝状ミクログリアに加えて、AAV ベクターは、LPS 処理マウスおよび SCA1-Tg マウスの脳において反応性ミクログリアを形質導入しました。 これは、パーキンソン病マウスモデルで以前に説明されているように、私たちの方法が神経炎症と神経変性を対象とした病理学的および前臨床実験に適用できるため、有利である可能性があります56。 さらに、AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T は、細胞内 Ca2+ 動員の G-CaMP7.09 ベースのモニタリングによって実証されたように、ミクログリアの機能研究に使用できる可能性があります (図 1)。 7）。

ミクログリアを標的とする AAV-PHP.B を静脈内に適用すると、ミクログリア特異的な GFP 発現が生じました。 しかし、予想外にも、発現された GFP はリソソーム分解経路に移行しました。 ミクログリアは末梢循環から脳に侵入するウイルスと戦う役割を果たすため、常在ミクログリアを感作するためにBBBを通過するときに、AAVキャプシドはグリコシル化の付加または切断などの何らかの修飾を受ける可能性があります。 この結果は我々にとって残念ではあるが、ミクログリアに特異的に導入遺伝子産物を静脈内送達するという点では部分的には成功した可能性がある。 さらに、BBB交差AAV（脳組織に直接注入されたAAVによるものではない）によるミクログリア活性化の根底にあるメカニズムを探ることで、常在ミクログリアを感作する重要な相互作用（または分子）の同定につながる可能性があり、それが変異体の発生を促進する可能性がある。ミクログリアを感作しないカプシド。

まとめると、我々の結果は、病理学的環境における反応性ミクログリアおよび健康な脳における分岐ミクログリアの形質導入に対するAAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.Tの直接脳注射の有効性を検証した。 。 大脳皮質を標的とするミクログリアは投与量と潜伏期間を慎重に調整する必要があるが、AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T は基礎研究や前臨床研究に有用であり、また、 miR-9 と miR-129-2-3p の配列は両方ともげっ歯類からホモサピエンスを含む霊長類まで広く共有されているため、ミクログリアを対象とした臨床研究で有望です。

この原稿の作成中に、ミクログリアに対して高い親和性を持つ AAV カプシド変異体が報告されました。 ただし、それらはミクログリアに特異的なものではありませんでした57。 これらのミクログリア指向性変異体キャプシドと当社のミクログリア標的化 Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T の組み合わせは、適用用量を大幅に削減し、大脳皮質におけるより高いミクログリア標的化の達成に役立つ可能性があります。

標的配列は、miRNA レジストリ (www.mirbase.org) から取得した miRNA 配列に基づいて設計されました。 miR.T の構築に使用されるオリゴヌクレオチドを補足表 1 に示します。 PGK.miR-9.T ベクターの場合、対応するセンス 1 (S1)、センス 2 (S2)、アンチセンス 1 (AS1)、およびアンチセンス 2( AS2) オリゴヌクレオチドをアニーリングし、親 AAV.PGK ベクターの導入遺伝子発現カセットの 3'-UTR にある KpnI および BamHI 制限部位にライゲーションしました。 PGK.miR-9.T.miR-129-2-3p.T または PGK.miR-9.T.miR-136-5p.T ベクターおよび S1、S2、S3、S4、AS1、AS2、AS3 の場合、およびＡＳ４オリゴヌクレオチドをアニーリングし、親ＡＡＶ．ＰＧＫベクターのＧＦＰ発現カセットの３'－ＵＴＲ内のＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にライゲーションした。

マウス Iba1 (Aif1) 遺伝子のエクソン 1 の最初の ATG の 5' 隣接領域の 1,678 bp フラグメントを使用しました。 Iba1 プロモーターをクローニングするために、マウス脳細胞由来のゲノム DNA を使用してネステッド PCR を実行しました。 プライマーセット Iba1-Nest-F (5'-CCTAGAGCCATCTTGTAAGG-3') および Iba1-Nest-R (5'-CGAGGAATTGCTGTTGAG-3') を DNA の最初の増幅に使用し、Iba1-F (5'-ATGCTCTAGActcgagTACTATAGGATGCATCGTGAAAACC-) 3')、2 番目は Iba1-R (5'-CATGGTGGCGaccggtGGCTCCTCAGACGCTGGTTG-3')。

Iba1、Iba1.miR-9.T、Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (Addgene ID: 190163)、または Iba1.miR-9.T.miR-136 の構築用-5p.T、対応する親 AAV.PGK ベクター内の PGK プロモーターは、XhoI および AgeI 制限部位でマウス 1.7 kb Iba1 プロモーターに置き換えられました。

AAV2/9 および AAV-PHP.B ベクターは、HEK293T 細胞 (HCL4517; Thermo Fisher Scientific、東京、日本) と 3 つのプラスミドを同時トランスフェクションすることによって作製されました。ウイルス粒子は、以前に記載されているように、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコール 8000 沈殿およびイオジキサノール連続勾配遠心分離を使用して精製されました 58。 精製された AAV ベクターのゲノム力価は、WPRE 配列を標的とするプライマー 5'-CTGTTGGGCACTGACAATTC-3' および 5'-GAAGGGACGTAGCAGAAGGA-3' を使用した Power SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher) を使用した定量的リアルタイム PCR によって決定されました。 発現プラスミドベクターを標準として使用した。 濃縮ベクター発現力価は 6.92 × 1012 ～ 6.30 × 1013 vg/mL の範囲でした。

この研究では、C57BL/6J マウス (4 ～ 8 週齢)、FVB/N-Tg (Pcp2-ATXN1*82Q) 5Horr マウス、およびそれらの野生型同腹子 (24 ～ 36 週齢) を使用しました。 すべての実験において、オスまたはメスのどちらかに偏ることを避けるために、マウスの性別に細心の注意が払われました。 すべての動物処置は、日本の動物の愛護及び管理に関する法律、及び日本学術会議によって発行された動物実験の適正な実施に関するガイドラインによって承認されたプロトコールに従って実施された。 実験プロトコールは、群馬大学の制度委員会によって承認されました（番号 21-063 および 21-065）。 苦痛を最小限に抑え、使用される動物の数を減らすためにあらゆる努力が払われました。

AAV ベクターの定位注射を、生後 4 週間の C57BL/6J マウス、症候性の 24 週齢 FVB/N-Tg マウス、およびそれらの野生型同腹子に対して実施しました。 マウスは、それぞれケタミン (100 mg/kg 体重 [BW]) およびキシラジン (10 mg/kg 体重 [BW]) の腹腔内注射によって麻酔されました。 手術中、足指つまみ反射を使用して麻酔深度を監視し、必要に応じて追加のケタミンとキシラジンを注射しました。 脳を露出させるために、注射部位の上にバリ穴を作成した。 AAV ベクター (AAV9.PGK.miR-9.T、AAV9.Iba1、AAV9.Iba1.miR-9.T、AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T、または AAV9) .Iba1.miR-9.T.miR-136-5p.T）をマウスの大脳皮質、線条体、および小脳に注射した。 接種量を減らして精度を高めるために、33 G 針を備えた 10 μL ハミルトン シリンジを注射に使用しました。 次の定位座標をウイルス注射に使用しました:大脳皮質、AP -1.0 mm、ML +1.5 mm、DV +0.9 mm。 線条体、AP -1.0 mm、ML +1.75 mm、DV +2.75 mm。 小脳、AP +6.5 mm、ML 0 mm、DV 2.0 mm (すべての値はブレグマに対する相対値です)。 AAV 溶液の総量は次のとおりです。大脳皮質、1.95 × 109 vg/マウス。 線条体、3.9 × 109 vg/マウス。 小脳、高用量注射の場合は 3.9 × 1010 vg/マウス。 大脳皮質、5.0 × 108 vg/マウス。 小脳、低用量注射の場合は 1.0 × 1010 vg/マウス。 適用速度は次のとおりでした: 大脳皮質、10 nL/分。 線条体、20 nL/分。 および小脳、200 nL/分。

AAV-PHP.Bの静脈内注射を、36週齢の症候性FVB/N-Tgマウスおよびその野生型同腹子に実施した。 深い麻酔後、30ゲージの針（08277;ニプロ、大阪、日本）。

マウスに 0.1 M PB (pH 7.4) 中の 4% パラホルムアルデヒドを経心臓的に灌流し、脳を 6 ～ 8 時間後固定し、1x PBS に移しました。 ミクロトーム (VT1000S または VT1200S; Leica、Wetzlar、ドイツ) を使用して、脳を大脳皮質、線条体、および小脳の矢状スライスの 50 μm 冠状スライスに切断しました。 スライスをブロッキング溶液（PBS中の5％正常ロバ血清、0.5％トリトンX-100、および0.05％NaN3）で1時間処理し、補足表2にまとめた一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートしました。 PBS で各 15 分間 3 回洗浄し、スライスを補足表 2 にまとめた二次抗体とともに 4 °C で 2 時間から一晩インキュベートしました。 最後に、スライスを PBS で 3 回リンスし、Hoechst 33342 核酸染色液 (Invitrogen) でインキュベートしました。カタログ番号 H1399)、ddH2O で洗浄し、ProLong Diamond/Glass Antifade Mountant (Thermo Fisher) にマウントし、暗所で 4 °C で保管しました。 免疫蛍光は、Zeiss LSM 800 レーザー走査型共焦点顕微鏡および付属のソフトウェア (Carl Zeiss、オーバーコッヘン、ドイツ) を使用して分析しました。

AAVベクターで形質導入された脳骨髄細胞の割合を免疫組織化学によって調べた。 大脳皮質、線条体、および小脳から得た厚さ50μmの組織切片をGFPおよびIba1について免疫染色した。 40x/0.95 NA 対物レンズを備えた Zeiss LSM 800 顕微鏡を使用して、0.5 μm 間隔の 30 個の連続した光学切片 (25,513.67 μm2、合計深さ 15 μm) をキャプチャし、その後画像を Zeiss Zen ソフトウェアで処理して最大強度投影を作成しました ( MIP）のイメージ。 各脳スライスから、重複することなく 32 枚の MIP 画像を取得し (合計 8​​16,386.42 μm2)、GFP 発現骨髄細胞の数を数えました。 Iba1 で同時標識された GFP 陽性細胞は脳骨髄細胞であると考えられました。 マウスあたり 3 枚の脳スライスと 4 ～ 9 匹のマウスを分析しました。 最低 500 個の細胞をカウントしました。

急性小脳スライスの共焦点 Ca2+ または GFP イメージングは​​、以前に記載されたように 27,39 、いくつかの修正を加えて実行されました。 小脳虫の傍矢状スライス（厚さ 200 ～ 250 μm）を、バイブロスライサー（VT1200S; Leica、ドイツ）を使用して調製し、（mM で）125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、1、 0 MgCl2、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、および 20 d-グルコース、および記録開始前に室温で 1 時間以上、95% O2 および 5% CO2 でバブリングしました。 画像処理と分析は、Andor iQ2 (Andor)、NIH ImageJ、Igor Pro8 (WaveMetrics)、および NH がカスタム作成したプログラムを使用して実行されました。

G-CaMP7.09 は、最近開発された遺伝子コード化 Ca2+ インジケーターで、細胞内 Ca2+ 濃度が上昇すると蛍光が増加します 43。 G-CaMP7.09 発現細胞からの Ca2+ シグナルを記録するために、×40 水浸対物レンズ (LUMPLFLN 40XW; Olympus 、東京、日本）、水冷 CCD カメラ（iXon3 DU-897E-CS0-#BV-500、北アイルランド、ベルファスト、アンドール）、および高速回転ディスク共焦点ユニット（CSU-X1、横河電機） 、東京、日本）正立顕微鏡（BX51WI、オリンパス、東京、日本）に取り付けられた。 ダイオード レーザー モジュール (Stradus 488-50; VORTRAN、カリフォルニア州サクラメント) からの 488 nm の光ビームを励起に使用し、放出された蛍光をバンドパス (500 ～ 550 nm) フィルターを通して収集しました。 記録中、小脳切片を室温でACSF浴溶液で灌流した。

ミクログリアの細胞内 Ca2+ 増加を誘発するために、ACSF 浴溶液に溶解した 100 μM ATP を重力供給浴塗布装置を介して細胞外に塗布しました 44。

1 回の連続記録が 10 分以上続いたため、画像のドリフト (並進ドリフト) が観察されることがありました。 このような場合、画像のドリフトは、ImageJ の Image Stabilizer プラグイン (http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html) を使用して修正されました。 各ピクセルの時間 t (Ft) での G-CaMP 蛍光からバックグラウンドを差し引き、ΔF/Fbasal を計算することで Ca2+ 依存の蛍光の相対増加を測定しました。ここで、Fbasal は、刺激前フレーム中に平均化された基礎蛍光強度です (つまり、 、ATP 適用前のフレーム）、ΔF = Ft−Fbasal。 バックグラウンド蛍光は、同じフレーム内の細胞構造が欠如している領域から得られました。 各関心領域 (ROI) の平均 ΔF/Fbasal 値がフレームごとに計算されました。 ROI は G-CaMP 陽性細胞構造上に配置されました。 フレーム内の複数の隣接する ROI が同じセル上にあるのか、それとも別の異なるセル上にあるのかを判断できませんでした。 したがって、単一の ROI をミクログリア細胞コンパートメントと呼びます。 通常、ミクログリアの突起領域の範囲は数百マイクロメートル以内に達し42、この研究の Ca2+ イメージング データは、2 匹のマウスの 5 つのスライスの 300 μm 以上離れた 12 の異なる視野から収集されました。 したがって、Ca2+ イメージング データセットは 12 を超えるミクログリアから得られたものであると安全に言えます。 G-CaMP 陽性細胞における ATP 誘導性の Ca2+ シグナルを定量化するために、ΔF/Fbasal のピーク振幅を ATP 適用開始後 120 秒の時間枠で測定しました。

GFP 陽性細胞の生きた形態学的動態を記録するために、共焦点 GFP 蛍光画像を 2 ～ 6 秒ごとに取得しました (200 ～ 250 ミリ秒の露光、512 × 512 ピクセル、ビニングなし)。 実験条件下では、GFP シグナルのシグナル対ノイズ比は、G-CaMP シグナルのシグナル対ノイズ比よりもはるかに高かった。 GFP イメージングの画像ドリフトは、Ca2+ イメージングの場合と同等に補正されました。

行動表現型が miRNA 標的配列の過剰発現によって影響を受けるかどうかを調べるために、生後 6 ～ 7 週目の C57BL/6J マウスに AAV-PHP.B.CBh-GFP (PHP.B.CBh-GFP) を静脈内注射しました。または AAV-PHP.B.CBh-GFP-miR-9.T.miR-129-2-3p.T (PHP.B.CBh-GFP-miR.T)、それぞれ力価 6 × 1011 vg。 3 週間後、トレッドミル (MK-610A/RKZ; 室町機械、東京、日本) でのロータロッド テストを使用して運動性能を評価しました。 マウスには30分間隔で3回の試験を実施した。 回転速度を 4 rpm から 50 rpm まで 300 秒で加速し、ロッドから脱落するまでの時間を測定しました。 ロータロッド テストの後、マウスはビームウォーキング テストを使用してさらにテストされました。 慣れさせた後、マウスをバー（長さ 600 mm、直径 11 mm）の一方の端に置き、バーの上を 3 回歩きました。 ビーム上を歩くマウスのパフォーマンスは、デジタル ビデオ カメラ (シャッター速度: 1/500、60 fps; HC-VX985M; パナソニック、大阪、日本) を使用して記録され、マウスが 600 秒のビーム上を歩く平均時間を記録しました。 mm長のビームを測定した。

内因性 miRNA の数を測定するために、8 週齢の C57BL/6J マウスに PHP.B.CBh-GFP または PHP.B.CBh-GFP-miR のいずれかを静脈注射しました。 T、力価は 6 × 1011 vg/マウス。 注射の 3 週間後、マウスを深く麻酔し、冷 PBS (-) で灌流しました。 次に、脳を素早く抽出し、左右の軸が正中線に沿った状態で 2 つの部分に分割しました。 左脳（組織学的観察用）を冷4%パラホルムアルデヒド（PFA）に4℃で一晩浸漬し、翌日1×PBS（-）を含む4% PFAに置き換えました。 次いで、ミクロトームＶＴ１２００Ｓ（Ｌｅｉｃａ）を使用して矢状切片（厚さ５０μｍ）を作製した。 切片を抗GFP (04404-84; Nacalai Tesque) および抗NeuN (MAB377; Merck) 抗体で蛍光免疫染色し、ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific) を使用してマウントしました。 免疫染色切片の顕微鏡写真は、BZ-X800蛍光顕微鏡(Keyence)を使用して得た。 脳の右半分を使用して miRNA レベルを測定しました。 大脳皮質、小脳、および線条体の頭頂葉を収集し、TRIzol 試薬 (Thermo Fisher Scientific) を使用して別々に配置しました。 BioMasher II (320103; Nippi、東京、日本) および Power Masher II (891300; Nippi) を使用して組織を均質化し、液体窒素で急速に急冷しました。 RNA が収集されるまで、組織は -80 °C で保存されました。 miRNeasy Mini Kit (217004; QIAGEN、ヒルデン、ドイツ) を使用して、miRNA を含む全 RNA を収集しました。 TaqMan MicroRNA 逆転写キット (4366596; Thermo Fisher Scientific) および miRNA 特異的逆転写プライマー (Assay ID:000583; 4427975; Thermo Fisher Scientific) を使用して、全 RNA を逆転写しました。 逆転写された miRNA サンプル中の miR-9、miR-129-2-3p、および miR-129-5p の量は、TaqMan プローブ (アッセイ ID:000583; 4427975; Thermo Fisher Scientific) および TaqMan Fast Advanced を使用して定量されました。リアルタイム PCR 用サーマルサイクラー (サーマルサイクラー ダイス リアルタイム システム II、タカラバイオ、草津、日本) 内のマスター ミックス (4444556; Thermo Fisher Scientific)。

以下の「共焦点ライブイメージング」に関する方法セクションに記載されているように、急性小脳スライスを準備および維持しました。 全細胞パッチクランプ記録は、MultiClamp 700 B アンプ (Molecular Devices、米国) を使用し、電圧クランプ モード (-70 mV の電位を保持) で室温でパッチ ピペット (1 ～ 4) を使用して小脳 PC の細胞体から実行されました。 MΩ) はホウケイ酸ガラス (Harvard Apparatus) または #0010 ガラス (PG10165-4、World Precision Instruments) から引き抜きました。 ピペット溶液は、（１３５ｍＭ）１３５Ｋ−グルコン酸塩、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＮａＣｌ、５Ｍｇ−ＡＴＰ、０．５Ｎａ−ＧＴＰ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、および５ｍＭ ホスホクレアチン（ｐＨ７．３）を含んでいた。 液間電位は補正されません。 記録された PC の受動的電気膜特性は、電圧クランプ モードでの過分極電圧パルス (-70 ～ -75 mV、持続時間 500 ms) によって引き起こされた 20 個の電流応答の平均トレースを使用して推定されました。 平行線維 (PF) 誘発 EPSC を記録するために、ACSF 細胞外溶液 (以下の「共焦点ライブ イメージング」セクションを参照) にピクロトキシン (100 μM) を添加して GABAA 受容体媒介抑制性シナプス電流をブロックし、平方根を適用することで PF を刺激しました。細胞外溶液で満たされ、小脳スライスの分子層に配置されたガラスピペットを通してパルス（60μs、10〜60μA）。 細胞外の緩いパッチを記録するために、パッチ ピペットを細胞外溶液で満たし、GFP 陽性 PC (緩い細胞付着) の体細胞の近くに置きました。 EPC-8増幅器(HEKA Elektronik GmbH、ドイツ)を使用して、ピペット電位0mVで少なくとも1分間、自発的活動電流(自発的ニューロン発火によって生成される)を記録した。 スパイクの発生は、電流レベルのしきい値処理を使用して検出されました。 検出された動作電流の波形が均一でない場合にはデータを破棄した。 検出されたすべてのイベントのスパイク間の間隔が各 PC で測定され、間隔の平均が記録された各 PC を代表する値とされました。 すべての電気生理学的データは、pCLAMP10 ソフトウェア (Molecular Devices) を使用して取得し、Igor Pro 8 (Wavemetrics) と Neuromatic (http://www.neuromatic.thinkrandom.com/)59 および NH によるカスタム作成の Igor 手順を使用して分析しました。

統計分析は、IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corp.、ニューヨーク州アーモンク) および GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。 すべてのデータは、正規分布やグループ間の均等分散など、各テストの統計的仮定に準拠しているかどうかチェックされました。 特に明記しない限り、データは平均±SEMとして表され、両側非対応t検定またはANOVA多重比較検定を使用して統計的有意性を評価しました。 ウイルス注射後 1 週間の小脳におけるミクログリア特異性の定量データは、データの正規性が確認されなかったため、ノンパラメトリック クラスカル ワリス検定によって分析され、統計的有意性を決定するために多重比較のためのボンフェローニ調整を伴う事後ダン検定が使用されました (表 1) ）。 PF EPSC振幅とペアパルス比の電気生理学的データは、それぞれHolm-Sidak法で補正された複数のt検定と二元配置反復測定ANOVAを使用して分析されました（補足図10d、e）。 統計的有意性は、P < 0.05 (または多重比較のために補正された同等の値) で考慮されました。 サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでしたが、サンプルサイズは以前の研究で報告されたものと同様でした。 電気生理学的実験のグラフでは、平均値を表す棒グラフと各データ点が並列して表示されます。 箱ひげ図では、中心線、箱の結合点、およびひげは、それぞれ中央値、25/75 パーセンタイル、および最小/最大値を表します。 統計分析の詳細は図の凡例に記載されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で使用した Iba1 プロモーターと 2 種類の miR.T を含むプラスミドは、Addgene から入手できます (Addgene ID: 190163)。 この研究に関連するミクログリアの形態学的変化は、論文と補足ムービーに記載されています。 関連する各グラフのソース データは、補足データ 1 ファイルで提供されます。 この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者 HH から入手できます。

カスタム作成の分析コードはすべて、リクエストに応じて対応する作成者から入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

著者らは、AAV ベクターの作製については大西麻子氏、マカロウ伸江氏、杉本彩子氏、マウスの飼育については杉山順子氏、いくつかのマウス実験については杉順子氏に感謝する。 本研究は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）の疾患研究のための統合神経技術による脳マッピングプログラム（脳・MINDS）の一部、助成番号JP19dm0207057、JP20dm0207057、JP21dm0207111、およびJSPS科研費（助成金番号15H04254）の支援を受けました。 、16K15477、18H02521、15K18330、19K06899、および22K06454）。

群馬大学大学院医学系研究科神経生理学・神経修復学分野〒371-8511 群馬県前橋市

Yukihiro Okada, Nobutake Hosoi, Yasunori Matsuzaki, Yuuki Fukai, Akito Hiraga, Keisuke Nitta, Yoichiro Shinohara, Ayumu Konno & Hirokazu Hirai

東北大学大学院歯学研究科疾患管理歯学口腔生理学分野（〒980-8575 仙台市）

Junichi Nakai

群馬大学先端研究拠点ウイルスベクターコア、〒371-8511 群馬県前橋市

Ayumu Konno & Hirokazu Hirai

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YO、AK、HH が実験を設計しました。 YO、KN、YS、YM、YF、AH、NH、AK が調査を実施しました。 NH は Ca2+ イメージング実験を実施しました。 JN は実験材料を提供しました。 YO が草案を作成し、HH が研究を完了しました。

Correspondence to Hirokazu Hirai.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に対する Guochun Jiang、Negin Martin、Sandra Siegert の貢献に感謝します。 主な編集者: Eliana Scemes、Veronique van den Berghe、Christina Karlsson Rosenthal。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

岡田 裕也、細井 直也、松崎 裕也 他 in vivoでのミクログリアの挙動を研究するツールとしてのミクログリアを標的とするアデノ随伴ウイルスベクターの開発。 Commun Biol 5、1224 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04200-3

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受信日: 2022 年 7 月 4 日

受理日: 2022 年 10 月 31 日

公開日: 2022 年 11 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04200-3

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